Hợp chất thứ cấp có 3 nhóm chính, bao gồm: nhóm terpenoid, nhóm phenolic,
nhóm alkaloid. Trong đó, tinh dầu và saponin thuộc nhóm terpenoid có vai trò quan trọng trong việc tạo hàng rào phòng thủ của thực vật. Chưa thấy có báo cáo nào nói về
tính kháng khuẩn của thực vật là từ tinh dầu, nên việc chiết tách tinh dầu không thực hiện trong đề tài này.
3.6.1 Chiết nhómt alkaloid
Theo quy trình đã đề cập ở trên, bước ban đầu phải dùng methanol hay ethanol
để phá vỡ tế bào, lôi kéo được càng nhiều loại hợp chất tự nhiên ra khỏi tế bào càng tốt. Việc dùng thêm acid acetic 10% trong ethanol để chuyển hóa alkaloid thành dạng muối hòa tan, một số quy trình chiết alkaloid dùng acid mạnh như H2SO4, HCl với nồng độ pha loãng. Kế đó kiềm hóa đến pH 9-10 để phóng thích alkaloid, loại alkaloid hoàn toàn khỏi muối, cuối cùng là lựa chọn một dung môi thích hợp để chiết alkaloid, là chloroform.
Một vài công bố nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc chiết alkaloid từ bã dược liệu
đôi khi có hiệu quả cao hơn khi dùng dịch chiết đầu tiên từ bột dược liệu. Theo quy trình chiết alkaloid từ bã dược liệu, đầu tiên acid hóa dung môi chiết để tăng hàm lượng phenolic và acid béo, loại bỏ các hợp chất này tốt nhất ở pH 4, bã dược liệu tiếp tục được ngâm với methanol hay ethanol để lấy các loại hợp chất tự nhiên, rồi tiếp tục quy trình với việc kiềm hóa và chiết bằng chloroform.
Định tính alkaloid từ dịch chiết
Hòa cắn alkaloid với nước acid H2SO4 2% trong ống nghiệm, nhỏ thuốc thử
Mayer, Wagner vào thì có phản ứng tạo màu. Thuốc thử Wagner cho màu nâu đỏ, thuốc thử Mayer cho màu vàng.
b) a)
Ảnh 3.9: Định tính alkaloid từ dịch chiết alkaloid cây Diệp hạ châu.
a) Trước khi cho thuốc thử, b) Sau khi cho thuốc thử
3.6.2 Chiết hợp chất phenolic
Theo như kết quả của tài liệu nghiên cứu về phương pháp tách chiết [15] thì chiết hợp chất phenolic và tannin có thể dùng acetone 70% và 50%, methanol 50%,
nhưng nồng độ chiết được hàm lượng phenolic và tannin nhiều nhất là acetone 70%.
Định tính hợp chất phenolic và tannin từ dịch chiết
Lấy một ít cắn hòa vào acetone 70% trong ống nghiệm, nhỏ một giọt FeCl3 vào quan sát, kết quả dịch chuyển màu xanh ve.
Ảnh 3.10: Định tính hợp chất phenolic và tannin từ dịch chiết phenolic cây Diệp hạ
châu.
3.6.3 Chiết saponin
Qua việc khảo sát phản ứng tạo bọt của bột Diệp hạ châu, nhận thấy Diệp hạ
châu không chứa saponin nên việc tách chiết thành phần saponin không được tiến hành.
Ảnh 3.11: Định tính thành phần saponin trong Diệp hạ châu.
Tiếp tục thử tính kháng khuẩn với cắn phenolic và cắn alkaloid, cắn alkaloid có tính kháng khuẩn, cắn phenolic không có tính kháng khuẩn (không xuất hiện vòng vô khuẩn). Lý thuyết cho thấy hợp chất phenolic gồm nhiều chất có tính kháng khuẩn
như tannin, coumarin, flavonoid...nhưng do bị hạn chế thời gian nên việc chiết tách và thử tính kháng khuẩn của nhóm hợp chất phenolic chưa được khảo sát.
Tiến hành xác định MIC với cắn alkaloid.
Bảng 3.5: Kết quả xác định MIC cắn alkaloid Diệp hạ châu
Gram dương Gram âm
St t (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nồng độ, mg bột dược
liệu/ml SA MRSA SF E.coli PA
1 5000 + + + + + 2 2500 + + + + + 3 1250 + + + + + 4 625 + + + + + 5 312,5 + + + + + 6 156,25 + + + + + 7 78,125 + + + + - 8 39,0625 - + + + - 9 19,53125 - - - - - 10 9,765625 - - - - -
Một số hình ảnh thực nghiệm xác định MIC cắn alkaloid Diệp hạ châu
Ảnh 3.12: Xác định MIC của cắn alkaloid cây Diệp hạ châu.
a) Staphylococcus aureus, b) MRSA, c) Streptococcus faecalis, d) Pseudomonas aeruginosa, e) E.coli
Dịch chiết alkaloid Diệp hạ châu có tính kháng khuẩn rất rõ, riêng hình 3.11 c) kết quả rất mờ là do chủng Streptococcus faecalis là vi khuẩn lactic, cần rất nhiều dinh
dưỡng để phát triển nhưng lại thử nghiệm trên môi trường NA nên chủng mọc yếu khó quan sát.
Như vậy, tính kháng khuẩn của Diệp hạ châu chủ yếu là tác động của nhóm alkaloid. MIC của cắn alkaloid Diệp hạ châu đối với MRSA, Streptococcus faecalis và
E.coli là 39,0625 mg bột dược liệu/ml, với Staphylococcus aureus là 78,125 mg bột
dược liệu/ml và với Pseudomonas aeruginosa là 156,25 mg bột dược liệu/ml.
a) b)
e) d)
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận
Trong quá trình thực hiện luận văn này, chúng tôi đã thu được các kết quả sau:
Bước đầu sàng lọc được một số loài thực vật có tính kháng vi khuẩn gây bệnh, bao gồm lá Bù ngót, Đu đủ, Anh đào, lá dứa, Thanh long, lá lốt, Dừa cạn, Dâm bụt, Sống đời, Xoan, Bồ công anh Việt Nam, Diệp hạ châu, Đinh lăng. Trong đó, chỉ Diệp hạ châu ức chế được cả 5 chủng khảo sát. Nồng độ ức chế tối thiểu của Diệp hạ châu
đối với Staphylococcusaureus ATCC 29213 và MRSA ATCC 43300 là 312,5mg bột
dược liệu/ml, với Streptococcus faecalis ATCC 29212 là 625mg bột dược liệu/ml, với
E.coli ATCC 25922 là 1250mg bột dược liệu/ml và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 là 2500mg bột dược liệu/ml.
Xác định thành phần chính có hoạt tính kháng khuẩn trong cây Diệp hạ châu là
nhóm alkaloid. Xác đinh MIC cắn alkaloid Diệp hạ châu đối với Staphylococcus aureus là 78,125 mg bột dược liệu/ml, MRSA, Streptococcus faecalis và E.coli là 39,0625 mg bột dược liệu/ml và đối với Pseudomonas aeruginosa là 156,25 mg bột
dược liệu/ml.
4.2 Kiến nghị
Nếu có điều kiện để tiếp tục đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng của các loài thực vật đã khảo sát trên đối tượng chuột, sau đó là thử nghiệm trên người, nhằm nghiên cứu bổ sung hoạt tính kháng khuẩn vào kem bôi ngoài da hoặc bổ sung vào các loại xà phòng nhằm tăng khả năng diệt khuẩn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
[1]Nguyễn Văn Đàm, Nguyễn Viết Tựu, 1985. Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc. Nhà xuất bản Y học.
[2]Trần Thị Thu Hằng, 2009. Thuốc sử dụng trong hóa trị niệu. Dược lực học. Nhà xuất bản phương Đông, pp. 681-685.
[3]Phạm Thị Hóa, Lê Kim Phụng và Lương Lệ Nhi, 2010. Hợp chất thiên nhiên của thuốc y học cổ truyền. Dược học cổ truyền. Bộ môn dược học cổ truyền, pp. 11-24. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tài liệu nước ngoài
[4]Adegoke AA, Iberi PA, Akinpelu DA, Aiyegoro OA, Mboto CI, 2010. Studies on phytochemical screening and antimicrobial potnetials of Phyllanthus amarus
against multiple antibiotic resistant bacteria. International Journal of Applied Research in Natural Products, 3 (3): 6-12
[5]Das K., R.K.S.Tiwari and D.K.Shrivastava, 2010.Techniques for evaluation of medicinal plant products as antimicrobial agent: Current methods and future trends.
Journal of Medicinal Plants Research, 4(2):104-111.
[6]Hongmei Lu, Xianjin Wu, Yizeng Liang and Jian Zhang, 2006. Variation in Chemical Composition and Antibacterial Activities of Essential oils from two species Houttuynia Thunb. Chem. Pharm. Bull, 54(7): 936-940.
[7]Marjorie Murphy Cowan, 1999. Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical Microbiology Reviews, 12(4): 564-582.
[8]Najlaa K.Al-Younis and Zirar M.Argushy, 2009. Antibacterial evaluation of some medicinal plants from Kurdistan region. J. Duhok University, 12(1): 256-261.
[9]Nazia Masood Ahmed Chaudhry and Perween Tariq, 2006. Anti-microbial activities of Cinnamomum Cassia against diverse microbial flora with its nutritional and medicinal impacts. Pak. J. Bot. , 38(1): 169-174
[10]Oluwafemi, Flora & Debiri, Folasade, 2008. Antimicrobial Effect of Phyllanthus amarus and Parquetina nigrescens on Salmonella typhi. African Journal of Biomedical Research, 11(2):215-219
[11]Pajaree Tongngok, Kornchanok Kaenkum, 2005. Antimicrobial activity of Northeastern Medicinal Plants in Thailand. UPS 1 (1): 40-46
[12]Prajakta J. Patil and Jai S. Ghosh, 2010. Antimicrobial Activity of Cantharanthus roseus-A Detailed stydy. British Journal of Pharmacology and Toxicology, 1(1): 40-44.
[13]Sabahat saeed and Perween Tariq, 2005.Antibacterial activities of Mentha piperita, Pisum sativum and Momordica charandica. Pak. J. Bot. , 37(4): 997- 1001.
[14]Sanaa O.Yagoub, Shami El Haj Al Safi, Braaha Ahmed and Asha Z.El Magbol.
Antimicrobial activity of some medicinal plants against some Gram positive, Gram negative and fungi. Faculty of Science and Technology, El Neelain University ; Ministry of Science and Technology, Khartoum, Sudan.
[15]Steven J.Cork and Andrew K.Krockenberger, 1991 .Methods and pitfalls of extracting condensed tannins and other phenolics from plants: insights from investigations on Eucalyptus leaves. Journal of Chemical Ecology, 17(1):123-134 [16]Vimalin J. Hena, 2010. Antibacterial Potentiality of Hibiscus rosa sinensis Solvent
Extract and Aqueous Extract Against Some Pathogenic Bacteria. Research Article, Coimbatore-640028: 21-23.
Tài liệu trên internet
[17]http://www.scribd.com/doc/20687478/alkaloid
[19]http://en.wikipedia.org/wiki/Streptococcus [20]http://www.textbookofbacteriology.net/staph.html [21]http://en.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus [22]http://en.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli [23]http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ecoliinfections.html [24]http://en.wikipedia.org/wiki/Methicillin-resistant_Staphylococcus_aureus [25]http://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa [26] http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/antibiot.htm [27]http://vietroselle.com/content/sp/caythuoc_details_view=12.php [28]http://www.stuartxchange.org/Katakataka.html [29]http://vnexpress.net/GL/Doi-song/2010/07/3BA1DB93/page_15.asp [30]http://thuocdongduoc.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=1172: cong-dung-cua-cay-song-doi&catid=2:su-dung-thuoc&Itemid=11 [31]http://vi.wikipedia.org/wiki/B%E1%BB%93_c%C3%B4ng_anh_Vi%E1%BB%87 t_Nam [32]http://www.medherb.com/Materia_Medica/Allium_sativum_- _Antibiotic_and_Immune_Properties.htm [33]http://www.scientificjournals.org/journals2007/articles/1017.htm [34]http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phuongphapthucnghiem- dinhtenvk.htm
PHỤ LỤC
Phụ lục A: Thuốc thử và môi trường nuôi cấy
1. Thuốc thử định tính alkaloid
Thuốc thử Mayer
Hòa 1,358g HgCl2 trong 60ml H2O. Hòa 5g KI trong 10ml H2O.
Thêm nước cất cho đủ 100ml.
Thuốc thử Wagner Iodine: 2,0g KI: 6,0g H2O: 100ml
2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường NA (Nutrient agar) Peptone: 5,0g Cao thịt bò: 3,0g NaCl: 5,0g Agar: 17,0g H2O: 1 lít pH 7 ± 0,2 ở 370C.
Môi trường MRS agar Peptone: 10,0g Cao thịt: 10,0g Cao nấm men: 5,0g (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
D-glucose: 20,0g Tween 20: 1ml Amonium acetate: 2,0g Sodium acetate: 5,0g Magiesium sulfate: 0,58g Manganous sulfate: 0,25g Agar: 17,0g H2O: 1 lít pH 6,5 ± 0,2 ở 370C Hấp tiệt trùng 1210C trong 15 phút, dùng trong 2 tuần.
Phụ lục B: Đường kính vòng vô khuẩn ở các lần định tính
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
VK Gram dương VK Gram âm
Mẫu nguyên liệu SA MRSA SF PA E.coli Bù ngót 9; 10,5; 9 9; 9 ; 9 - - - Xùm sụp 7; 7; 7 - - - - Thơm - 11; 11; 11 - - - Đu đủ 8,5;10,5;10,5 10; 10; 10 - - - Anh đào 17; 18 14; 11; 13 - - - Dứa 13; 13 10; 9 - - - Thanh long 15,5; 16; 15 11; 12 - - - Lốt 11; 11 12; 12,5 - - - Dừa cạn 9; 9; 9,5 10; 11 14; 15 - 8 Dâm bụt 10;10,5;10,5 11;10,5;12,5 16; 13; 14 - 10,5;11,5;11,5 Sống đời 15; 15; 15 12; 10; 12 - - 13; 12,5; 13 Xoan - 13; 11; 12 - - 10; 10; 9 Diệp hạ châu 20;19;21 18;16;17 15,5;15;16 12;10;12,5 17; 18; 19 Đinh lăng 8,5; 8,5 - 10; 10 - 8,5; 10,5 Cải xoong - - - - - Dòi - - - - - Bồ công anh VN - 10; 10; 9 - - 8; 8; 8 Khế - - - - - Bạch hoa xà - - - - - Bù xích - - - - -