Tách chiết là phương pháp phân đoạn dược liệu từ mô thực vật bằng cách sử dụng dung môi thích hợp và kỹ thuật tách chiết. Dung môi khuếch tán vào mô thực vật rắn và hòa tan hợp chất phân cực. Chất lượng của dịch chiết thực vật phụ thuộc vào vật liệu và chọn lựa phương pháp tách chiết [5]
1.4.2 Phương pháp định tính và định lượng
Sau khi có được dịch chiết thực vật thô, có nhiều phương pháp phân tích hóa học và xác định cấu trúc của các hợp chất thứ cấp trong thực vật. Một số phương pháp nghiên cứu được dùng để định tính, định lượng như:
Phương pháp sắc ký bản mỏng
Là phương pháp tách chiết, có bản chất là sắc ký lỏng rắn mà pha tĩnh rắn được trải thành lớp mỏng trên bản kính, nhựa hay kim loại. Giọt mẫu nhỏ trên đường xuất phát cách rìa 2-3cm, rìa bản được nhúng vào một dung môi thích hợp (pha động).
Dưới tác dụng của lực mao quản, dung môi chuyển động dọc theo lớp hấp phụ và vận chuyển các cấu tử của hỗn hợp với các vận tốc khác nhau nhằm tách các cấu tử. Sự khuếch tán vừa theo chiều dọc, vừa theo chiều ngang.
Phương pháp sắc ký khí
Là kỹ thuật phân tách trong đó pha động là khí hoặc hơi.
Phương pháp phổ khối lượng
Phương pháp phổ khối lượng là một kỹ thuật dùng để đo đạc tỷ lệ khối lượng trên điện tích của ion, dùng thiết bị chuyên dụng là phổ khối kế. Phương pháp này được ứng dụng để xác định các hợp chất chưa biết bằng cách dựa vào khối lượng của phân tử hợp chất hay từng phần tách riêng của nó; xác định kết cấu các đồng vị của các thành phần trong hợp chất; xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần tách riêng của nó; định lượng hợp chất trong một mẫu dùng các phương pháp khác; nghiên cứu cơ sở của hóa học ion thể khí; xác định các thuộc tính vật lý, hóa học hay sinh học của hợp chất với nhiều hướng tiếp cận khác nhau.
Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography)
Là phương pháp chia tách, trong đó pha động là chất lỏng, pha tĩnh là chất rắn chứa trong cột được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ.
1.4.3 Phương pháp kiểm tra tính kháng khuẩn
Kiểm tra tính kháng khuẩn là một phương pháp đánh giá dược lý của thực vật.
Dược lý, về cơ bản là tác dụng của các hợp chất thứ cấp hiện diện trong thực vật, không phải là một chất duy nhất mà là sự kết hợp của nhiều chất (Parekh và cộng sự,
2005) [5]. Có nhiều phương pháp kiểm tra tính kháng khuẩn, mà tùy vào nhà nghiên cứu, sự chọn lựa mà có kết quả khác nhau.
Phương pháp khuếch tán đĩa thạch (agar disk diffusion assay).
Là phương pháp kiểm tra tính kháng khuẩn được phát triển từ 1940 (Heatley, 1944). Tiến trình được “National Committee for Clinical Laboratory Standards” chấp nhận và được sử dụng rộng rãi cho đến nay, được mô tả bởi Bauer, Kirby, Sherris và Truck (còn được gọi là phương pháp Kirby-Bauer). Phương pháp này được sử dụng rộng rãi để xác định tính kháng khuẩn của dịch chiết thực vật. Trong phương pháp này, giấy lọc tiệt trùng 6mm được bão hòa với dịch chiết thực vật ở nồng độ mong muốn.
Các miếng giấy ngâm tẩm này được đặt lên môi trường thạch rắn thích hợp như Mueller Hinton (Mueller và Hinton, 1941), Trypton Soy agar (Louren và cộng sự, 2004) hay Nutrient agar (Doughari, 2006). Môi trường được tiệt trùng trước khi tiến hành kiểm tra trên vi khuẩn. Mật độ vi sinh chỉ thị là 108 CFU/ml trên một đĩa thạch (Baris và cộng sự, 2006) được xác định bằng mật độ quang của dịch nuôi cấy qua đêm có độ đục bằng ống McFarland 0,5. Đĩa sau đó được ủ ở 24 giờ, 370C hoặc 48 giờ, 250C (nấm) (Salie và cộng sự, 1996; Baris và cộng sự, 2006). Sau khi ủ, đường kính vòng vô trùng được đo bằng mm, giảm 80% tỷ lệ phát triển [5].
Ảnh 1.1: Vòng vô khuẩn
Phương pháp khuếch tán thạch giếng (agar well diffusion assay).
Nguyên tắc của phương pháp này giống như của phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Đĩa thạch được đục vài lỗ đường kính 6-8mm, các lỗ này chứa một lượng xác
định nồng độ chất cần kiểm tra, sau đó đem ủ ở điều kiện thích hợp với vi sinh vật chỉ thị (Mbata và cộng sự, 2006; Norrel và Messely, 1997) [5].
Phương pháp pha loãng micro (broth microtitre)
Phương pháp pha loãng micro hay phương pháp độ chuẩn micro, là phương pháp rất hữu ích dùng xác định MIC của lượng lớn mẫu thử. Minimum Inhibitory Concentrations trong vi sinh là nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật sau khi ủ qua đêm. Trong phương pháp này, chất được kiểm tra được hòa trong dung môi hay DMSO. Pha loãng mẫu giảm dần hai lần với nước hay môi trường Mueller Hinton rồi nuôi vi sinh vật chỉ thị với nồng độ 1x106 CFU/ml. Ủ đĩa thạch thử nghiệm ở 370C trong 24 giờ. Sau khi ủ qua đêm, xác định khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật [5].
Phương pháp pha loãng macro (Broth macrodilution assay)
Về nguyên tắc thì phương pháp pha loãng macro giống với phương pháp pha loãng micro, nhưng được tiến hành trên các ống. Một bộ ống nghiệm chứa các nồng độ khác nhau của dịch chiết thực vật, thêm lượng vi sinh vật chỉ thị. Sau khi ủ, ống được kiểm tra sự tăng trưởng bằng cách đo độ đục ở bước sóng 620nm [5].