Chuẩn bị vi sinh vật chỉ thị như phần kiểm tra tính kháng khuẩn.
Chuẩn bị nồng độ thử tính kháng khuẩn
Hòa tan cắn với dung môi dùng chiết cắn đó, với nồng độ dung môi là 20%. Pha loãng cắn nồng độ giảm dần 2 lần.
Xác định nồng độức chế tối thiểu
Ngâm giấy lọc đã hấp tiết trùng với từng nồng độ pha loãng ở trên trong 10 phút.
Tiến hành như phần kiểm tra tính kháng khuẩn, đặt từng miếng giấy lọc đã ngâm dich chiết pha loãng vào đĩa thạch có chứa vi khuẩn chỉ thị, kèm chứng âm để đối chứng.
Ủ 370C trong 24 giờ. Xem kết quả nồng độ nhỏ nhất nào có vòng kháng khuẩn.
2.2.7 Tách chiết từng nhóm hợp chất thứ cấp
2.2.6.1 Tách chiết alkaloid a. Chiết alkaloid
Hình 2.2: Quy trình chiết alkaloid bằng chloroform [8]
Thuyết minh quy trình:
5g vật liệu khô được ngâm với 40ml dung dịch 10% (acid acetic, ethanol) trong 24 giờ. Lọc dịch chiết thô, bã được chiết lại cũng bằng dung dịch trên. Dịch lọc hai lần
được cô cách thủy còn 2ml rồi đem kiềm hóa bằng NH4OH đạt pH 9-10. Chiết alkaloid bằng CHCl3 3 lần, mỗi lần 15ml, chia nhỏ dịch chiết và dung môi để chiết, hiệu suất sẽ cao. Cô cách thủy đến cắn, cắn đó là alkaloid.
b. Định tính alkaloid
Định tính alkaloid bằng phương pháp tủa:
Lấy 1 ít cắn hòa vào H2SO4 2%, cho thuốc thử vào xác định, lắc đều, chờ 30 phút, quan sát và ghi nhận kết quả.
Bảng 2.2: Định tính alkaloid
Thuốc thử Dragendorff Valse-Mayer Bouchardat Liều dùng Vài giọt Vài giọt Vài giọt Kết quả Tủa vàng cam đến đỏ Tủa trắng hay vàng Tủa nâu
Loại tạp (24 giờ) Lọc Acid acetic Ethanol CHCl3 Bột dược liệu Cô đến 1/3 thể tích Kiềm hóa, pH 9-10 NH4OH Chiết 3 lần Bay hơi CHCl3 Alkaloid
2.2.6.2 Tách chiết hợp chất phenolic và tannin a. Chiết hợp chất phenolic và tannin
Quy trình chiết hợp chất phenolic và tannin:
Hình 2.3: Quy trình chiết hợp chất phenolic và tannin bằng acetone [15].
Thuyết minh quy trình:
5g bột dược liệu ngâm với 25ml acetone 70% trong một ngày, dịch chiết được lọc và cô cách thủy đến cắn, cắn là hợp chất phenolic.
b. Định tính hợp chất phenolic và tannin
Lấy một ít cắn phenolic và tannin hòa với acetone 70% trong ống nghiệm, nhỏ
thuốc thử FeCl3 5% vào ống nghiệm, nếu dịch chuyển màu xanh ve, xanh đen, xanh
lục thì chứng tỏ dịch chiết chứa phenolic và tannin.
2.2.6.3 Tách chiết saponin a. Chiết saponin
Quy trình chiết saponin được đề xuất như hình 2.3: Bột dược liệu
Chiết (24 giờ) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bay hơi
Phenolic và tannin Acetone 70%
Hình 2.4: Quy trình chiết saponin [1]
Thuyết minh quy trình:
5g bột dược liệu ngâm với 30ml cồn 98% ở nhiệt độ phòng. Sau 14 giờ, lọc lấy dịch, bã được ngâm với cồn 76% để chiết lại. Sau 3 giờ, lọc lấy dịch. Trộn dịch chiết lần 1 và lần 2 lại với nhau đem cô cách thủy cho đến khi còn khoảng 20ml. Cho vào dịch này 20ml n-butanol để chiết. Chia lượng n-butanol thành nhiều lần chiết để đạt hiệu suất cao hơn. Thu dịch chiết, đem cô cách thủy đến cắn. Cắn hòa với 10ml methanol rồi thêm 20ml diethyl ether vào để lắng qua đêm. Lọc thu saponin kết tủa. Lặp lại 3 lần quá trình kết tủa. Saponin thu được là saponin toàn phần.
b. Định tính saponin
Phản ứng tạo bọt: Lấy 1 ít cắn saponin hòa với nước, lắc mạnh, nếu cắn chứa saponin thì sẽ xuất hiện bọt bền trong 10 phút.
Tiếp tục kiểm tra tính kháng khuẩn của từng nhóm hợp chất thứ cấp đã phân loại ở trên, nếu nhóm nào có tính kháng khuẩn thì tiếp tục xác định nồng độức chế tối thiểu. Bột dược liệu Trích lần 1, 12 giờ Trích lần 2, 3 giờ Cô cách thủy Chiết Cô cách thủy Hòa tan Tủa saponin Lọc Saponin Cồn 76% Cồn 98% n-butanol Methanol Diethyl ether
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Xử lý nguyên liệu
Loài thực vật được dùng làm dược liệu phải trải qua một quá trình chọn lọc, xử
lý và kiểm tra lâu dài. Tất cả các công đoạn trên đều có các nguyên tắc và yêu cầu sản phẩm để đảm bảo hoạt tính dược liệu cao nhất. Thu hái là một công việc khởi đầu trong tiến trình sàng lọc dược liệu, phải đúng bộ phận và thời điểm thu hái.
Mẫu thực vật dùng trong đề tài chủ yều là lá cây, một vài mẫu là toàn bộ cây. Với lá cây, thu hái lúc cây đang tăng trưởng tốt, lá xanh tươi, không vàng úa hay bị
héo. Với mẫu thu hái toàn cây, chọn thời điểm lúc cây đang ra hoa hay kết trái, xanh tốt. Mẫu thực vật thân bò, thu phần mắt có rễ xuất hiện (phần mắt có rễ chứa nhiều hợp chất thứ cấp).
Rửa sạch để loại đất đá, bụi bặm bám trên cây.
Với mẫu thực vật dùng ngay thì không cần phải xử lý tiếp. Nhưng nếu chưa
dùng ngay thì phải xử lý kịp thời, chủ yếu là sấy khô để giữ được phẩm chất và hiệu quả điều trị. Tùy theo tính chất và chủng loại mà áp dụng phương pháp làm khô khác nhau như phơi râm, phơi ngoài nắng, hong, sấy nhiệt độ thấp hay nhiệt độ cao như:
Dược liệu có mùi thơm thì phơi râm, hay sấy ở nhiệt độ thấp để tránh khỏi mất tinh dầu.
Dược liệu là hoa, lá thì phải phơi trong râm, để nơi thoáng gió, không bị ánh nắng chiếu trực tiếp.
Dược liệu chứa nhiều nước cần làm khô nhanh bằng cách sấy ở nhiệt độ
cao, khoảng 60-700C.
Mẫu thực vật dùng trong đề tài thường được sấy ở nhiệt độ 400C trong 72 giờ để đạt ẩm độ thích hợp [5].
Ẩm độ là một trong những nhân tố quan trọng liên quan đến công tác bảo quản
dược liệu nhanh. Ẩm độ cao làm dược liệu hô hấp nhiều, làm tiêu hao hoạt chất. Dược liệu và thuốc phiến là những sinh chất, mặc dù đã được sấy khô nhưng vẫn tiếp tục sinh hóa và hô hấp. Hô hấp càng nhiều thì hoạt chất càng bị tiêu hao. Hô hấp nhiều dẫn đến gia tăng nhiệt lượng và tích tụ hơi nước, nấm mốc phát triển nhiều, cứ thế
nhân tố này kích thích nhân tố kia làm vật liệu mau hỏng hóc. Để làm tốt công tác bảo quản dược liệu thì cần đưa độẩm của dược liệu về ngưỡng an toàn theo quy định, như:
Rễ cây: 15% Lá cây: 10-12% Vỏ cây: 10-12% Hoa: 10-12% Hạt: 10% Dược liệu chứa tinh bột: 10-14% Dược liệu chứa tinh dầu: 10% Dược liệu chứa đường: 15-20%
Bảo quản dược liệu ở nhiệt độ phòng, nơi khô thoáng [3].
Bảng 3.1: Kết quảẩm độ nguyên liệu
Stt Mẫu nguyên liệu Độẩm, % Stt Mẫu nguyên liệu Độẩm, % 1 Mùng ngót 10,88 11 Sống đời 10,34 2 Xùm sụp 11, 67 12 Xoan 11,89 3 Thơm 9,45 13 Diệp hạ châu 10,54
4 Đu đủ 8,41 14 Đinh lăng 8,67 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5 Anh đào 9,19 15 Cải xoong 11,24
6 Dứa 11,39 16 Hoàn ngọc 10,01 7 Thanh long 10,24 17 Bồ công anh Việt Nam 11,45 8 Lốt 9,51 18 Khế 9,78 9 Dừa cạn 9,92 19 Bạch hoa xà 10,32 10 Dâm bụt 8,84 20 Bù xích 9,53
Như vậy, độẩm nguyên liệu sử dụng trong thí nghiệm đạt yêu cầu của ngưỡng an toàn
được quy định.
3.2 Chiết hợp chất thứ cấp thô
Việc lựa chọn dung môi dùng để chiết là công việc quyết định hiệu quả của cả
quá trình chiết tách. Dung môi dùng trong quá trình chiết phải có độc tính thấp, dễ bay
hơi ở nhiệt độ thấp, quá trình hấp thụ dung môi chiết xuất của dược liệu phải nhanh, dễ
dàng bảo quản sản phẩm và không gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích khác.
Nước cũng được dùng để chiết hợp chất thứ cấp có tính kháng khuẩn trong thực vật. Nhưng hoạt tính kháng khuẩn tìm thấy trong dung môi hữu cơ thì hiệu quả hơn so
với chất chiết là nước. Nước hòa tan flavonoid (chủ yếu là anthocyanins) không có ý nghĩa trong thử nghiệm tính kháng khuẩn và hợp chất phenolic hòa tan trong nước thì chỉ có tính chống oxy hóa. Một báo cáo kết luận rằng việc chiết tannin và hợp chất phenolic hiệu quả cao nếu dùng dung môi acetone hơn là methanol [15]. Chloroform
chỉ hiệu quả với những hợp chất không phân cực. Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng hợp chất kháng khuẩn từ thực vật là chất thơm hoặc hợp chất hữu cơ no, được chiết xuất
ban đầu bằng methanol hay ethanol. Do đó, việc điều tra sơ bộ tính kháng khuẩn của một loài thực vật ban đầu người ta dùng dung môi ethanol, methanol hay nước [5].
3.3 Vi sinh vật chỉ thị
Môi trường NA là môi trường dinh dưỡng hạn chế, mật độ khuẩn lạc mọc trên
môi trường này rất thấp, chỉ 102 -103 CFU, vì thế việc quan sát kết quả đôi khi gặp khó
khăn vì mật độ khuẩn lạc thấp. Hơn nữa, màu môi trường NA trên đĩa thạch và màu một số khuẩn lạc như Streptococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, E.coli tương đối giống nhau, nên việc quan sát khuẩn lạc càng gặp khó khăn, ảnh hưởng tới việc ghi nhận kết quả.
a) b) c)
e) d)
Bảng 3.2: Hình dạng các chủng vi khuẩn dùng trong đề tài.
Tên chủng Loại Gram
Hình dạng vi
thể Hình dạng khuẩn lạc
Staphylococcus aureus Tụ cầu Tròn mép, bóng mẩy, màu trắng
MRSA Tụ cầu Tròn mép, bóng mẩy, màu vàng nhạt trong Streptococcus faecalis Gram dương Liên cầu Tròn mép, bóng mẩy, nhỏ, trắng vàng
E.coli Que Tròn mép, bóng mẩy, màu vàng nhạt trong Pseudomonas aeruginosa Gram âm Que Tròn mép, bóng mẩy, màu vàng nhạt trong
Một số hình ảnh vi thể các chủng vi khuẩn dùng trong đề tài.
Ảnh 3.1: Hình dạng vi thể các chủng vi khuẩn
a) Staphylococcus aureus, b) MRSA, c) Streptococcus faecalis, d) E.coli, e)
3.4 Tính kháng khuẩn của thực vật (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hợp chất thứ cấp thô từ thực vật được chiết bằng methanol và để khô đến cắn. Hòa tan cắn bằng methanol với nồng độ methanol thấp. Dùng phương pháp khuếch tán thạch giếng hay khuếch tán thạch đĩa để kiểm tra tính kháng khuẩn của dịch chiết thô thực vật.
Phương pháp khuếch tán thạch giếng chỉ khác một điểm duy nhất là có đục lỗ
giếng trên mặt thạch so với phương pháp khuếch tán thạch đĩa. Đục giếng trên mặt thạch có ưu điểm là giới hạn mẫu thử trong thể tích giếng, hạn chế tối đa tác dụng của dung môi hữu cơ hòa tan mẫu thử và dễ dàng thao tác. Bênh cạnh đó, nhược điểm của
phương pháp có đục giếng là kết quả có thể bịảnh hưởng bởi dụng cụ tạo giếng, tức là khi tạo giếng phải hơ lửa đầu tròn dụng cụ, nếu để chưa nguội thì dụng cụ tạo giếng có thể giếng chết vi khuẩn chỉ thịkhi thao tác; khó xác định kết quả với nồng độ mẫu thử
ít. Với phương pháp không đục giếng, vì trực tiếp đặt mẫu thử lên mặt thạch nên sự
khuếch tán của các chất có tác dụng giết vi khuẩn có thể có hiệu quả hơn; tuy nhiên
cũng có bất lợi là kết quả dễ bị ảnh hưởng bởi dung môi hữu cơ hòa tan mẫu. Để hạn chế nhược điểm của cả hai phương pháp, cần cẩn thận khi thao tác với que tạo giếng và quá trình ngâm tẩm giấy lọc vào dịch mẫu thử, cần để ráo dịch lỏng trước khi đặt mẫu thử lên mặt thạch hay vào giếng. Thời gian mẫu thử khuếch tán ra đĩa thạch cũng
là lúc vi khuẩn chỉ thị tăng sinh. Nếu mẫu thử có chứa hoạt chất ức chế vi khuẩn thì vi khuẩn không thể mọc được trên phần chất khuếch tán, do đó tạo vòng vô khuẩn ta có thể quan sát được.
Nguyên liệu được khảo sát có khối lượng khô từ 2,9-4,3g, cắn được hòa tan với
Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn:
Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Gram (+) Gram (-) St t Mẫu nguyên liệu SA MRSA SF PA E.coli 1 Bù ngót 9,5 9 - - - 2 Xùm sụp 7 - - - - 3 Thơm - 11 - - - 4 Đu đủ 9,8 10 - - - 5 Anh đào 17,5 12,5 20 - - 6 Dứa 13 9,5 15 - - 7 Thanh long 15,5 11,5 14 - - 8 Lốt 11 12 - - - 9 Dừa cạn 9,2 10,5 14,5 - 8 10 Dâm bụt 10,3 11,3 14,3 - 11,2 11 Sống đời 15 11,3 - - 12,8 12 Xoan - 12 - - 9,6 13 Diệp hạ châu 20 17 15,5 11,5 18 14 Đinh lăng 8,5 - 10 - 9,5 15 Cải xoong - - - - - 16 Hoàn ngọc - - - - - 17 Bồ công anh VN - 9,6 - - 8 18 Khế - - - - - 19 Bạch hoa xà - - - - - 20 Bù xích - - - - -
SA: Staphylococcus aureus, SF: Streptococcus faecalis, PA: Pseudomonas aeruginosa
d)
b) c)
a)
Cây Dừa cạn
Ảnh 3.2: Tính kháng khuẩn của cây dừa cạn
a) MRSA, b) Streptococcus faecalis, c) Staphylococcus aureus, d) E.coli, thang 10mm Cây Dừa cạn có tính kháng với các chủng vi khuẩn Gram dương. Ảnh 3.2 cho thấy dịch chiết thô của dừa cạn tạo vòng vô khuẩn trên đĩa thạch các chủng Gram
dương dùng trong thực nghiệm, chứng âm là giấy thấm màu trắng không gây tác động kháng khuẩn.
Cây Dừa cạn đã được nghiên cứu về tác dụng y học từ những năm 1970, với tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, trị ung thư, thông tiểu... Hoạt tính của cây Dừa cạn chủ
yếu là do thành phần alkaloid Vinblastin và Vincristin là những chất ức chế mạnh sự
phân bào [27]. Dịch chiết cây Dừa cạn ức chế được vi khuẩn Staphylococcus aureus,
Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa [12] nhưng thực nghiệm lại không ức chế được Pseudomonas aeruginosa. Điều này có thể giải thích do thao tác thí nghiệm, và việc chọn môi trường NA cho thí nghiệm ảnh hưởng đến việc quan sát kết quả. Mặt khác, điều kiện thổ nhưỡng của địa phương nơi thu hái lá cây
Dừa cạn sử dụng trong nghiên cứu có ảnh hưởng sâu sắc đến thành phần hợp chất thứ
a)
Cây Dâm bụt
Ảnh 3.3: Tính kháng khuẩn của cây Dâm bụt
a) MRSA, b) Streptococcus faecalis, c) E.coli,d) Staphylococcus aureus, Thang 10mm
Ảnh 3.3 cho thấy hoạt tính kháng vi khuẩn của dịch chiết cây Dâm bụt. Cây Dâm bụt có thể kháng vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Theo dân gian, Dâm bụt có thể chữa u nhọt, người ta lấy đọt Dâm bụt giã nát và đắp vào khối u nhọt trên người, vài ngày sau sẽ khỏi.
Theo kết quả báo cáo trên Herbal Tech Industry (11/2010), lá và hoa cây Dâm bụt đều có tính kháng khuẩn, các chủng vi sinh được thử nghiệm trong báo cáo này gồm Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, E.coli, Pseudomonas aeruginosa thì dịch chiết nước nóng từ lá và hoa Dâm bụt đều có tính kháng Staphylococcus aureus, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
E.coli và Pseudomonas aeruginosa. Với dịch chiết methanol thì dịch chiết lá kháng
được Staphylococcus aureus và E.coli, không kháng được Pseudomonas aeruginosab
[16]. Như vậy, kết quả thực nghiệm của chúng tôi tương đồng với báo cáo.
Cây Bù ngót
Ảnh 3.4: Tính kháng khuẩn của cây Bù ngót a) Staphylococcus aureus, b) MRSA, Thang 10mm
Cây Bù ngót có khả năng kháng chủng Staphylococcus aureus và chủng kháng kháng sinh MRSA, tuy nhiên khả năng kháng chủng MRSA yếu, thể hiện qua một vòng vô khuẩn mờ quanh miếng giấy tẩm dịch chiết.
Theo nghiên cứu của Pajaree Tongngok và Kornchanok Kaenkum (6/2005, Thái Lan) thì dịch chiết methanol lá Bù ngót có khả năng ức chế E.coli,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa chỉ ở nồng độ 5mg/đĩa nhưng kết quả cũng không rõ ràng [11]. Như vậy, khả năng ức chế 2 chủng Gram âm trong đề tài này không được ghi nhận với cây Bù ngót, có thể do nồng độ mẫu thử nhỏ nên chưa
thể xác định.
Sống đời
Ảnh 3.5: Tính kháng khuẩn của cây Sống đời
a) E.coli, b) MRSA, c) Staphylococcus aureus, Thang 10mm
Ảnh 3.5 cho thấy dịch chiết cây sống đời kháng được chủng Gram dương và
Gram âm.
Theo trang Philippine Medicinal Plants [28] thì dịch chiết lá cây Sống đời có tác dụng chống lại hầu hết các vi sinh vật ngoại trừ Candida albican. Dịch chiết methanol có hoạt tính chống lại Sta. aureus, E. faecalis, B. subtilis và Ps. aeruginosa