Một trong những yếu tố quan trọng sống còn của sự đa đạng sinh học là sự sinh sản. Đó cũng là yếu tốt cần thiết để phát triển đàn gia súc và để nâng cao hiệu quả khai thác trong chăn nuôi. Trong tự nhiên khả năng sinh sản của
động vật nói chung và vật nuôi nói riêng đã được con người quan tâm khai thác tận dụng và làm chủ trên cơ sở các kết quả nghiên cứu về sinh học sinh sản. Thụ tinh nhân tạo, cấy truyền phôi, thụ tinh trong ống nghiệm vv… là những thành tựu mà con người đạt được vào thế kỷ XX. Việc sử dụng các tế bào, mô trong đó có tế bào tinh trùng , tế bào trứng, tế bào phôi …vv dưới dạng còn tươi đã hạn chế hiệu quả sử dụng vì thời gian giống của chúng quá nhanh. Lợi ích thực tế của những công trình nghiên cứu về sinh học lạnh đã thỏa mãn từng bước nhu cầu hiện đại hóa ngành chăn nuôi. Sau những nghiên cứu bảo quản thành công tinh trùng của nhiều loại động vật bằng kỹ thuật đông lạnh với chất bảo vệ sinh học lạnh như Glycerol trong ni tơ lỏng - 1960C, đã có rất nhiều thành tựu về đông lạnh phôi cũng đạt được trên nhiều loại động vật có vú. Công nghệ phôi đã khai thác triệt để đặc tính quý hiếm để gây tạo giống vật nuôi tốt và đẩy nhanh tiến bộ kỹ thuật di truyền, nâng cao năng suất thịt sữa, hạ giá thành hạn chế dịch bệnh …vv thì với động lạnh phôi bảo quản trong nitơ lỏng 1960C đã nâng ý nghĩa của cấy truyền phôi lên tầm cao hơn trong sự chủ động về không gian, thời gian và hợp lý hóa trong sử dụng phôi vào sản xuất cũng như trong lĩnh vực nghiên cứu, trong lưu giữ quỹ gen cũng như trong giữ trữ vật liệu sinh học vừa nâng cao hiệu quả sản xuất, vừa giảm được chi phí chăn nuôi, vừa tiện lợi trong kỹ thuật sinh sản, vừa tận dụng được khả năng sinh sản của con cái.
Kỹ thuật đông lạnh và bảo quản phôi là chỗ dựa cho việc tổ chức và duy trì sự hoạt động ở các ngân hàng phôi của nhiều loại vật nuôi cũng như các giống quý, các động vật hoang dã đang bị diệt vong. Nhờ có phôi đông lạnh và bảo quản mà có thể thương mại hóa trong nước cũng như trên phạm vi toàn thế giới, đối với nhiều loại động vật có vú, đặc biệt là trong lĩnh vực buôn bán, vận chuyển gia súc. Vậy kỹ thuật đông lạnh phôi là gì ? Là quá trình chuyển phôi từ trạng thái sinh lý bình thường (trong cơ thể mẹ hoặc ngoài cơ thể mẹ với nhiệt độ ở 370C) sang trạng thái tiềm sinh đông lạnh để
cất giữ, bảo quản ở nhiệt độ lanh sâu - 1960C. Phôi đông lạnh vẫn có thể sống, phát triển bình thường sau giải đông và đem cấy cho con cái nhận phôi đồng pha hoặc sử dụng trong các kỹ thuật sinh sản khác (Hoàng Kim Giao, 2003) [8].
1.3.2. Lịch sử phát triển
Vào cuối những năm 40, Chang đã có những nghiên cứu đầu tiên về bảo quản phôi thỏ ở nhiệt độ thấp. Đến năm 1949, sau khi phá hiện và sử dụng Glycerol trong môi trường pha loãng để đông lạnh tinh trùng gà ở -700C đạt kết quả tốt đã đặt nền móng cho bảo quản đông lạnh các tế bào và mô ở các loại động vật. Năm 1952, Smith đã đông lạnh phôi thỏ ở nhiệt độ thấp - 790C và - 1960C nhưng sau khi giải đông chỉ còn 1% phôi với một tế bào tiếp tục phân chia. (Smith, A. U. 1952) [31] Sau 20 năm, những nghiên cứu của Whititingham (D. G. Whittingham, S. P. Leibo, P. Mazur, 1972) [34] đã đưa ra phương pháp cơ bản để bảo quản phôi chuột, tạo cơ sở khoa học ban đầu có ý nghĩa lớn về sinh học lạnh đối với phôi động vật, đóng góp cho sự phát triển công nghệ bảo quản dữ trữ phôi đông lạnh trên các loại động vật khác nhau vào những năm của thập kỷ 90.
Wilmut và Whittingham (1972) (D. G. Whittingham, S. P. Leibo, P.
Mazur, 1972) [34] đã mô tả riêng rẽ những việc đầu tiên của sự đông lạnh phôi động vật ở nhiệt độ thấp cho phép dữ trữ phôi ở trạng thái đông lạnh.
Các tác giả đã thu được những con chuột từ cấy phôi lạnh – 1960C, với tốc độ hạ nhiệt thấp (0.20C - 2.00C/phút) để đông lạnh và tốc độ nâng nhiệt cao (40C -250C/phút) để giải đông cùng với việc sử dụng dimethysulfoxit (DMSO) làm chất bảo vệ sinh học đông lạnh hay sinh học lạnh. Từ kết quả này, nhiều phương pháp đông lạnh có những đặc điểm tương tự và phù hợp với phôi và trạng thái phôi của mỗi loài động vật như bò, dê, cừu, thỏ, lợn….vv
Vào những năm 1977-1982, Willadsen và công sự (1977, 1978), Trounson và công sự (1978), Lehn-jensen và cộng sự (1978), Massip và cộng sự (1979), Schneider và cộng sự (1980) (Theo Hoàng Kim Giao, 2003) [8] đã
đổi mới phương pháp đông lạnh và giải đông theo chiều hướng giảm bớt các bước cân bằng với các chất bảo vệ sinh học lạnh, tăng nhanh tốc độ đông lạnh và giải đông mà vẫn bảo tồn sức sống của phôi hạn chế được những biến đổi về hình thái học của phôi và đạt được kết quả tốt ở bò và chuột. Ngày nay, việc đơn giản hóa kỹ thuật đông lạnh và giải đông với phương pháp một bước (one step method) do Leibo và cộng sự (1992) và Renard và cộng sự (1982) (Theo Hoàng Kim Giao, 2003) [8] đã góp phần thúc đẩy việc sử dụng phôi đông lạnh trong sản xuất và phục vụ nghiên cứu khoa học , cùng với việc ra đời các thiết bị đông lạnh với chương trình tự động hóa đã góp phần đưa công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học trong chăn nuôi nói riêng đạt được nhiều thành tựu mới
Ở nước ta, các phương pháp đông lạnh phôi bò đã được nghiên cứu ứng dụng từ năm 1984. Phương pháp đông lạnh nhanh sau khử nước bộ phận ở nhiệt độ hiện trường trên phôi bò đã thành công với hơn 67% có cấu trúc màng nguyên vẹn, 80% phôi sau giải đông tiếp tục phát triển và tỷ lệ có chửa sau cấy phôi đông lạnh là hơn 40% (Bùi Xuân Nguyên và cộng sự, 1984) (Theo Hoàng Kim Giao, 2003) [8]. Năm 1986, bê sinh ra từ cấy phôi đông lạnh nhập nội giống Charolais trên đất Lâm Đồng, rồi đến các giống Hà Lan…vv trên đất Phù Đổng, Cầu Diễn (Hà Nội) Ba Vì (Hà Tây), Củ Chi (Thành phố Hồ Chí Minh)… (Hoàng Kim Giao, 2003) [8].
1.3.3. Phương pháp đông lạnh phôi
Với quan điểm sinh học lạnh, các tế bào phôi không khác biệt với các loại tế bào khác. Nhiều nghiên cứu về đông lạnh và giải đông trên các loại tế bào khác nhau về siêu cấu trúc (Thực khuẩn thể, hồng cầu) đã chỉ ra tầm quan trọng của việc duy trì khả năng tồn tại của số lượng nước nội bào khi chúng chuyển thành băng đá trong quá trình hạ nhiệt độ. Vấn đề này là yếu tố cơ bản tác động đến sự sống của tế bào phôi, hiệu quả của sử dụng phôi đông lạnh, tỷ lệ thụ thai bằng cấy phôi đông lạnh…vv (Hoàng Kim Giao, 2003) [8].
1.3.3.1. Phương pháp cơ bản để bảo quản tế bào phôi
Khi hạ nhiệt độ, sự xuất hiện tinh thể nước đá đầu tiên đã đánh dấu sự bắt đầu thay đổi giai đoạn đông băng. Điều này chỉ có thể xẩy ra khi nhiệt độ ở dưới hoặc bằng độ hạ băng điểm của dung dịch. Theo định luật về độ hạ băng điểm (Loi Raoult) của dung dịch phụ thuộc vào nồng độ của các chất hòa tan. Vì thế mà độ hạ băng điểm của dung dịch phosphate loại PBS là – 0.80C (J.P.Renard, 1982) (Theo Betteridge, K.J, 2006) [18].
Bên trong tế bào chứa hơn 80% nước, nồng độ này cao hơn bên ngoài.
Vì vậy sự thay đổi giai đoạn đông lạnh ở bên trong tế bào xẩy ra ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ bên ngoài . Trong quá trình đông lạnh, những tinh thể nước đá được tạo thành trước tiên ở môi trường bên ngoài tế bào, đồng thời với nồng độ chất hòa tan tăng lên nhanh chóng. Đáp lại với sự tăng ấp suất thẩm thấu này, nước sẽ đi ra ngoài tế bào, gây nên dung tích tế bào bị giảm. Mức độ mất nước tế bào lại phụ thuộc vào tốc độ đông lạnh (Hạ nhiệt nhanh hay chậm, T0C/Phút), tốc độ này phải ở trên tốc độ giới hạn, mà tốc độ giới hạn lại thay đổi theo loại tế bào, khả năng tạo băng đã nội bào tăng lên cũng gây ra những tổn hại tế bào do đông lạnh hay giải đông. Tốc độ lạnh ở dưới tốc độ giới hạn thì sự sống của tế bào gắn liền với sự biến đổi các tính chất của dung dịch, trong đó nồng độ chất hòa tan cũng đồng thời tăng lên ở bên ngoài tế bào. Trong môi trường huyền phù (Vừa thể lỏng vừa tinh thể) nước tạo thành băng đá một cách từ từ và bên trong tế bào sẽ mất nước để duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu với bên ngoài tế bào.
Như vậy sự hiện diện của một tinh thể nước đã nội bào và những hiệu ứng của dung dịch là hai yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh để quyết định khả năng sống sót của tế bào.
Dựa vào những cơ sở nói trên, phương pháp cơ bản để đông lạnh phôi chuột đã được xác định, phân tích từng giai đoạn ta có thể hiểu được những biến đổi mà các tế bào phôi phải chịu đựng và có thể sống sót trong quá trình đông lạnh và giải đông (Hoàng Kim Giao, 2003) [8].