Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tạo phôi tươi từ đàn bò cái của trang trại bò sữa TH true milk
* Chọn bò cái
Chọn bò cho phôi: Chọn 35 bò cái từ đàn bò cái H.F thuần của công ty.
Những bò này có thể chất khỏe mạnh, khối lượng trên dưới 350 kg, chu kỳ động dục đều đặn. Số bò cái trên được chia làm 5 nhóm (mỗi nhóm 7 con) tương ứng với 5 đợt gây siêu bài noãn trong thí nghiệm này.
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm bò cái cho phôi (con)
Chỉ tiêu Đợt
1 2 3 4 5 Tổng
Số bò được chọn cho phôi
Số bò dự kiến được phối tinh tạo phối
7 4
7 4
7 4
7 4
7 4
35 20
Gây siêu bài noãn
Tiêm hormone gây siêu bài noãn theo quy trình như bảng dưới:
Bảng 2.2a. Quy trình tiêm hormone gây siêu bài noãn
Ngày Buổi Tên hormone Liều (ml)/con
Ngày 0 Động dục 12
Ngày 9-11
Sáng CL Evaluation
Sáng FSH 2,5
Chiều FSH 2,5
Ngày 12 Sáng FSH 2
Chiều FSH 2
Ngày 13 Sáng FSH 1
Chiều FSH 1
Ngày 14
Sáng FSH 0,5
Lutalyse 5
Chiều FSH 0,5
Lutalyse 2
Ngày 16
Động dục
Phối giống sau12
tiếng động dục 1st AI+ 2 cc GnRH Phối giống sau 24
tiếng động dục 2st AI
Ngày 23 Giội rửa
Xác định bò động dục bằng quan sát mắt thường với tần suất 2h/ lần, và kết hợp phần mềm phát hiện động dục afiact II của afikim, Israel bằng theo dõi bước đi từ chíp điện tử treo trên chân bò.
Từ 7 bò của mỗi đợt được tiêm hormone gây siêu bài noãn, chọn 4 con/đợt điển hình nhất để phối tinh và thu phôi.
Thu hoạch và phân loại phôi
* Giội rửa để phân loại phôi
Giội rửa thu phôi theo phương pháp không phẫu thuật với dụng cụ chuyên ngành Foley catheter hai đường (đường dung dịch vào ra và đường khí vào ra), dụng cụ được đưa theo đường sinh dục có hướng dẫn, điều chỉnh bằng tay qua trực tràng (Barusell và cs, 2006) [17].
Dung dịch giội rửa phôi là dung dịch D- PBS phosphate (Dulbecco Phosphate Buffered saline).
Khi nuôi cấy hoặc đông lạnh, dung dịch trên được bổ sung thêm 10- 20% FCS hoặc 4g BSA/1lit.
Dung dịch rửa thu phôi từ tử cung chảy ra theo hệ thống bình thông nhau vào bộ phận lọc cú kớch thước 0,22à.sau đú đưa vào đĩa petry, sau 10- 15 phút soi tìm.
* Phân loại phôi
Soi tìm phôi trên kính hiển vi soi nổi có độ phóng đại ≥12 lần, đánh giá phân loại phôi dùng kính hiển vi có độ phóng đại ≥40 lần (Maarten Drost, 1991) [27].
Phôi được đánh giá phân loại theo giai đoạn phát triển: không thụ tinh, phôi 2,4,8,16 tế bào, phôi dâu, phôi nang, phôi nang trương nở, phôi thoát màng. Bên cạnh phân loại theo giai đoạn phát triển còn phân loại theo chất lượng: phôi không sử dụng (trứng không thụ tinh, phôi chậm phát triển, phôi thoái hóa) và phôi có thể sử dụng; phôi có thể sử dụng được phân thành các loại: rất tốt, tốt, trung bình và xấu.
2.3.2. Chuẩn bị đàn bò cái nhận phôi
Bố trí thí nghiệm đối với đàn bò cái nhận phôi như sau:
Bảng 2.2b. Bố trí thí nghiệm trên đàn bò cái nhận phôi
Đợt (1) (2) (3)
Con % %
1 2
641 523
65 – 75 65 - 75
60 – 70 60 - 70
Tổng 1.164 65 - 75 60 - 70
Ghi chú:
(1) Là số lượng bò cái được chọn để tiêm PGF2α gây động dục
(2) Là tỷ lệ dự kiến bò cái động dục so với bò cái được chọn để tiếm PGF2α
(3) Là tỷ lệ dự kiến bò cái đủ tiêu chuẩn truyền cấy phôi so với bò cái động dục (so với 2)
Tổng số 1164 bò tơ chưa phối giống lần nào, độ tuổi từ 14-18 tháng tuổi, chiều cao từ 122cm trở lên, khối lượng cơ thể khoảng 350 kg đã được chọn lọc để nhận phôi truyền cấy. Tiêm kích thích cho bò bằng hóc môn PGF2α 2,5 ml/con để gây động dục đồng pha.
Theo dõi động dục bằng quan sát mắt thường với tần suất 2 giờ, kết với sử dụng phần mềm Afiact II Afimilk - Israel
Ghi chép theo dõi cụ thể để tính sự đồng pha.
Trước khi cấy phôi, bò được khám qua trực tràng ở thời điểm sau 7 ngày động dục thông qua sự phát triển của thể vàng để đánh giá chất lượng động dục. Bò đạt tiêu chuẩn nhận phôi là bò có thể vàng điển hình, không có nang trứng trội, chia làm 3 loại thể vàng bao gồm loại 1, loại 2, loại 3. Loại 1 là loại thể vàng có đường kính trên 2cm, Loại 2 là loại thể vàng có đường kính từ 1,5-2cm và loại 3 là loại thể vàng có đường kính dưới 1,5. Thường bò dùng để nhận phôi là bò có chất lượng thể vàng loại 1 và loại 2.
2.3.3. Cấy truyền phôi cho bò cái nhận phôi
Tổng số 569 bò cái đạt tiêu chuẩn nhận phôi đã được xác định ở giai đoạn trước đã được truyền cấy phôi trong hai đợt. Đợt 1 có 40 con được cấy phôi tươi, 247 con được cấy phôi đông lạnh. Đợt 2 tương ứng là 40 và 242 con. Phôi đông lạnh là phôi đã được xác định giới tính (Phôi cái) nhập khẩu từ Mỹ, phôi tươi là phôi loại tốt (Chưa phân ly giới tính ) được chọn sau khi
thu hoạch phôi. Bố trí thí nghiệm xem tại Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm bò cái được truyền cấy phôi
Chỉ tiêu Đợt 1 Đợt 2 Tổng
Số bò cái được cấy phôi tươi Số bò cái được cấy phôi đông lạnh
40 247
40 242
80 489
Tổng 287 282 569
* Cấy truyền phôi
Cấy truyền phôi cho bò nhận bằng phương pháp không phẫu thuật với dụng cụ súng cấy phôi.
Phôi được cấy cho bò nhận ở ngày thứ 7,8 sau động dục,
Phôi đông lạnh được giải đông và cấy trực tiếp giống như tinh bò đông lạnh.
Phôi tươi đảm bảo chất lượng được nuôi cấy trong dung dịch nuôi cấy và hút vào cọng rạ đem cấy ngay trong khoảng thời gian ≤ 5-8 giờ sau giội rửa.
Vị trí cấy phôi tại 1/3 phía trên của chóp sừng tử cung.
* Xác định bò cái đậu thai từ truyền cấy phôi
Có hai phương pháp để xác định bò có thai sau khi phối giống hoặc sau khi cấy truyền phôi.
Phương pháp khám thai bằng tay thông qua thực tràng: đây là phương pháp phổ biến được dùng để khám thai, bò sau khi cấy phôi được 35 ngày hay tuổi phôi phôi được 42 ngày thì bác sỹ thý y tiến hành khám thai thông qua trực tràng.
Phương pháp khám thai bằng máy siêu âm: bò sau cấy phôi 28 ngày tức tuổi phôi được 35 ngày thì bác sỹ thú y tiến hành khám thai bằng máy siêu âm để xác định bò mang thai hay không.
* Theo dõi bê con sinh ra từ truyền cấy phôi
Cân khối lượng của bê lúc sơ sinh và cai sữa bằng cân điện tử có độ chính xác tới 100g.
Tính tăng khối lượng của bê/ngày bằng công thức dưới đây.
Tăng khối lượng (g/con/ngày) = (KL cai sữa (kg) - KL sơ sinh (kg)
x 1000 (g) 65 ngày
2.3.4. Xử lý số liệu
Giá trị trung bình và phần trăm được tính bằng máy tính bấm tay và bảng tính Excel.
Chương 3