Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn
3.1.3. Ảnh hưởng của một số chất ựiều tiết sinh trưởng ựến khả năng tạo cây hoàn chỉnh in vitro
hoàn chỉnh in vitro
Thông thường các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy cần ựược cấy chuyển sang một môi trường khác ựể kắch thắch tạo rễ. Ở một số loại cây, các chồi sẽ tạo rễ khi trực tiếp chuyển trồng ra ựất, giai ựoạn này thông thường từ 2 Ờ8 tuần. Khi cây ựã có ựủ rễ ựạt chất lượng ựược chuyển ra ựất trồng. Trong quá trình này, cây chuyển trực tiếp từ ựiều kiện vô trùng, bão hoà hơi nước ra ựiều kiện bên ngoài tự nhiên khó khăn hơn nên cần phải có ựiều kiện chăm sóc ựặc biệt và giá thể trồng phù hợp thì cây mới có thể sống sót và ựảm chất chất lượng cây con cung cấp cho sản xuất (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2005). Vì vậy cần tạo ựược cây hoàn chỉnh trước khi ựưa ra trồng ngoài vườn ươm sẽ giúp tăng tỷ lệ sống sót của câỵ
Nhằm tìm ra môi trường ra rễ phù hợp cho cây Dừa cạn trong ựiều kiện in vitro, chúng tôi tiến hành các thắ nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng riêng rẽ và tổ hợp α- NAA và IBA tới sự hình thành rễ từ các chồi có chất lượng tốt ựã thu ựược trong các thắ nghiệm trước.
3.1.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp α - NAA và than hoạt tắnh tới sự hình thành và phát sinh rễ của chồi Dừa cạn trong ựiều kiện in vitro
Năm 1937, Went và Thiman ựã phát hiện ra chất ựiều tiết sinh trưởng auxin. α- NAA là chất ựiều tiết sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin. Chất này có tác dụng tắch cực trong việc tăng khả năng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tắnh của các enzym và ảnh hưởng mạnh mẽ ựến trao ựổi nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng cacbon trong môi trường. Ngoài ra, nó còn có vai trò quan trọng trong việc kắch thắch sinh trưởng, phân chia tế bào và tạo rễ bất ựịnh. (đỗ Năng Vịnh, 2005).
Các chồi hữu hiệu thu ựược trong các thắ nghiệm nhân nhanh ựược cấy chuyển sang môi trường tạo rễ. Môi trường sử dụng trong thắ nghiệm này là môi trường MS có bổ sung thêm 0,5g/l than hoạt tắnh . Nồng ựộ α- NAA sử dụng ở các công thức lần lượt là 0,5; 1,0; 1,5mg/l Theo dõi sau 4 tuần cấy chuyển thu ựược kết quả trong bảng 3.6.
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của αααα - NAA và than hoạt tắnh ựến sự tạo rễ của chồi Dừa cạn in vitro
CTTN Tỷ lệ chồi tạo rễ (%) Số rễ (rễ/chồi) Chiều dài rễ (cm) Chiều cao chồi (cm) Số lá (lá/chồi) Chất lượng mẫu cấy 1 MS+ 0.5g/l than hoạt tắnh (đC) 77,78 2,69 0,77 2,63 6,95 ** 2 MS+ +0.5g /l than hoạt tắnh +0.5mg/l α- NAA 100 3,13 1,53 3,18 9,33 ** 3 MS+ +0.5g/l than hoạt tắnh +1.0mg/l α- NAA 100 3,65 2,33 3,61 9,89 *** 4 MS+ +0.5g/l than hoạt tắnh +1.5mg/l α- NAA 100 3,96 1,06 3,85 10,52 * CV(%) 4,3 6,5 3,2 3,5 LSD0,05 0,27 0,17 0,20 0,60 Ghi chú:
*: Rễ ngắn,gốc rễ sùi to, lá xoăn, ngọn trùn **: Rễ ngắn, trắng,lá xanh phát triển bình thường ***: Rễ dài, trắng, lá to xanh mượt, chồi phát triển tốt
Số liệu ở bảng 3.6 cho thấy:
Công thức ựối chứng (MS+ 0,5g than hoạt tắnh) có tỷ lệ tạo rễ thấp nhất (77,78%), trong khi tất cả các công thức thắ nghiệm có bổ sung tổ hợp cả than hoạt tắnh và α-NAA thì tỷ lệ tạo rễ ựều ựạt tối ựa là 100%.
Nồng ựộ α-NAA bổ sung vào môi trường tăng dần thì các chỉ tiêu: số lượng rễ , chiều cao chồi và số lá cũng tăng theọ Khi tăng dần nồng ựộ α-NAA từ 0 Ờ 1,5mg/l thì số lượng rễ cũng tăng từ 2,69 lên 3,96 (rễ/chồi), chiều cao chồi tăng từ 2,63 ựến 3,85 (cm) và số tăng từ 6,95 lên 10,52 (lá/chồi)..
Riêng chỉ tiêu:chiều dài rễ thì khi tăng nồng ựộ α-NAA từ 0-1,0mg/l thì chiều dài rễ cũng tăng từ 0,77 lên 2,33 (cm) nhưng tiếp tục tăng lên 1,5mg/l thì gốc rễ bị sùi to và chiều dài rễ giảm xuống còn 1,06 (cm).
đặc ựiểm chung của ựa số rễ tạo ra ở thắ nghiệm này là: rễ mảnh, trắng. Số lượng rễ/ chồi không cao nhưng từ những rễ chắnh phân nhánh ra nhiều rễ nhỏ.
Công thức ựối chứng (MS+ 0,5g than hoạt tắnh) có tất cả các chỉ tiêu theo dõi ựều thấp nhất: Số rễ là 2,69 (rễ/chồi), chiều dài rễ là 0,77(cm), chiều cao chồi 2,63(cm) và số lá là 6,59(lá/chồi) nên chất lượng chồi của công thức này cũng kém nhất: Chồi nhỏ, lá xanh nhỏ, phát triển bình thường
Công thức 3 (MS+ +0,5g/l than hoạt tắnh +1,0mg/l α- NAA) có chiều cao (3,61cm) và số lá trung bình (9,89 lá/ chồi), không phải là công thức có chiều cao và số lá trung bình tốt nhất nhưng chồi của công thức này ựược ựánh giá là có chất lượng tốt nhất vì: chồi xanh, lá to mượt, phát triển tốt. Công thức 4 (MS+0,5g/l than hoạt tắnh +1,5mg/l α- NAA) có chiều cao và số lá cao nhất trong tất cả các công thức thắ nghiệm nhưng chất lượng chồi lại không tốt vì: lá xoăn, khảm, ngọn trùn. Lý do xảy ra hiện tượng này có thể giải thắch vì ở công thức 4 gốc rễ bị sùi to làm giảm chiều dài và chất lượng rễ nên ảnh hưởng tới sự sinh trưởng phát triển của chồị
Kết luận: Với cây Dừa cạn nồng ựộ α- NAA thắch hợp nhất ựể hình thành phát sinh và phát triển rễ ựồng thời chất lượng cây ựạt tốt nhất trong ựiều kiện in vitro
là:1,0mg/l
Hình 3.6: Ảnh hưởng của αααα - NAA và than hoạt tắnh ựến sự tạo rễ từ chồi Dừa cạn in vitro
3.1.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA tới sự hình thành và phát sinh rễ của Dừa cạn trong ựiều kiện in vitro.
để so sánh hiệu quả kắch thắch tạo rễ chúng tôi tiến hành thắ nghiệm với 3 nồng ựộ IBA là 0,5; 1,0; 1,5 mg/l. Thắ nghiệm sử dụng các chồi hữu hiệu cao khoảng 1,0 cm.
CT3 CT4
CT2 CT1 CT1
Các chồi này ựược cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung thêm IBA theo nồng ựộ nói trên.
Kết quả thắ nghiệm (theo dõi sau 4 tuần) ựược trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7: Ảnh hưởng IBAựến sự tạo rễ của chồi Dừa cạn in vitro
CTTN Tỷ lệ Tỷ lệ chồi tạo rễ (%) Số lượng rễ (rễ/chồi) Chiều dài rễ (cm) Chiều cao chồi (cm) Số lá (lá/chồi) 1(đC) MS 64,81 2,21 0,40 2,89 6,91 2 MS+0.5mg/lIBA 81,48 5,75 1,91 3,81 10,27 3 MS+1.0mg/lIBA 100 7,48 2,40 4,34 10,59 4 MS+1.5mg/lIBA 100 8,94 1,37 3,58 10,04 CV(%) 5,4 5,1 4,2 4,7 LSD0,05 0,62 0,14 0,29 0,83
Từ bảng số liệu 3.7 chúng tôi nhận thấy:
Các công thức khác nhau có sự khác nhau về các chỉ tiêu theo dõi, cụ thể như sau: Nồng ựộ IBA càng tăng thì tỷ lệ tạo rễ và số lượng rễ càng caọ Khi nồng ựộ IBA bổ sung vào môi trường tăng từ 0-1.5mg/l thì tỷ lệ tạo rễ tăng từ 64.81% lên ựến 100%, số lượng rễ tăng từ 2.21-8.94 (rễ/chồi). Công thức ựối chứng (MS) có tỷ lệ chồi tạo rễ thấp nhất là 64.81%. và số lượng rễ cũng nhỏ nhất là 2.21 (rễ/ chồi). Công thức 4 (MS +1.5mg/l IBA) có tỷ lệ tạo chồi và số lượng rễ là cao nhất (tỷ lệ tạo chồi:100%, số lượng rễ trung bình là 8.94 (rễ/chồi)).
Các chỉ tiêu theo dõi còn lại là: Chiều dài rễ, chiều cao chồi và số lá/chồi tuân theo quy luật sau: Khi tăng nồng ựộ IBA tăng từ 0-1,0mg/l thì các chỉ tiêu này cũng tăng theọ Công thức 3 (MS+1,0mg/l IBA) tỏ ra là tốt nhất với: chiều dài rễ là 2,40(cm), chiều cao chồi là 4,34 (cm) và số lá là 10,59 (lá/chồi). đặc ựiểm rễ của các công thức này là: rễ mảnh, trắng, có phân nhánh. Tuy nhiên khi tăng nồng ựộ IBA lên 1,5mg/l thì ựặc ựiểm rễ có nhiều thay ựổi: rễ màu trắng ngà, rễ củ, hầu như không phân nhánh, dễ bị gẫy vụn, chất lượng rễ kém làm ảnh hưởng ựến khả năng hút chất dinh dưỡng cho nên làm chiều cao, số lá và chất lượng chồi cũng giảm theọ Với ựặc ựiểm rễ củ, dễ dàng bị gẫy vụn như vậy thì khi trồng ra ngoài vườn ươm khả năng sống của cây sẽ không caọ
Hình 3.7: Ảnh hưởng của IBA ựến sự tạo rễ từ chồi Dừa cạn in vitro
3.1.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp α-NAA và IBA tới sự hình thành và phát sinh rễ của chồi Dừa cạn trong ựiều kiện in vitro
để tìm ra môi trường tạo rễ hoàn chỉnh nhất chúng tôi tiến hành nội dung nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp hai chất IBA và α-NAA ựến khả năng hình thành và phát triển rễ ựồng thời thu ựược cây có chất lượng tốt nhất. Thắ nghiệm ựược bố trắ với 3 nồng ựộ α-NAA và 3 nồng ựộ IBẠ Kết quả thắ nghiệm ựược trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8: Ảnh hưởng tổ hợp αααα - NAA và IBAựến sự tạo rễ của chồi Dừa cạn in vitro
CTTN Nồng ựộ IBA (mg/l) Tỷ lệ chồi tạo rễ (%) Số lượng rễ Chiều dài rễ (cm) Chiều cao chồi (cm) Số lá 1(đC) MS 64,81 2,21 0,40 2,89 6,91 2 MS+ 0,5mg/lα-NAA+ 0,5mg/l IBA 100 - - 4,12 11,00 3 MS+ 0,5mg/lα-NAA+ 1,0mg/l IBA 100 - - 3,58 10,22 4 MS+ 0,5mg/lα-NAA+ 1,5mg/l IBA 100 - - 3,29 9,59 5 MS+ 1,0mg/lα-NAA+ 0,5mg/l IBA 100 - - 3,37 9,85 6 MS+ 1,0mg/lα-NAA+ 1,0mg/l IBA 100 - - 3,15 9,44 7 MS+ 1,0mg/lα-NAA+ 1,5mg/l IBA 100 - - 2,93 9,03 8 MS+ 1,5mg/lα-NAA+ 0,5mg/l IBA 100 - - 3,02 9,30 9 MS+ 1,5mg/lα-NAA+ 1,0mg/l IBA 100 - - 2,81 8,93 10 MS+ 1,5mg/lα-NAA+ 1,5mg/l IBA 100 - - 2,71 8,82 CV(%) 3,8 3,1 LSD0,05 0,21 0,49 CT1 CT2 CT3 CT4
Từ bảng 3.8, chúng tôi ựưa ra một số nhận xét sau:
Các công thức thắ nghiệm có sự kết hợp giữa IBA và α-NAA thì tỷ lệ chồi tạo rễ ựạt 100%, trong khi ựó công thức ựối chứng (MS) tỷ lệ chồi tạo rễ chỉ là 64,81%
Công thức ựối chứng có rễ mảnh, trắng nhưng khi có sự kết hợp giữa IBA và α-NAA làm cho gốc rễ sùi thành khối callus, trong khối ựó có rất nhiều ựầu rễ li tị Vì vậy, chúng tôi không tiến hành ựo ựếm ựược chiều dài và số lượng rễ. mà chỉ quan sát ựịnh tắnh.
Nồng ựộ IBA và α-NAA càng tăng thì khối callus càng to và rễ li ti xuất hiện càng ắt, chiều cao và số lá cũng giảm làm chất lượng chồi giảm. Công thức 2 (MS+0,5 mg/l IBA+0,5mg/l α-NAA) là công thức tốt nhất với chiều cao chồi là 4,12(cm), số lá trung bình là 11,00 (lá/chồi), gốc rễ sùi nhỏ, nhiều ựầu rễ li ti xuất hiện. Công thức 10 (MS+1,5mg/l IBA + 1,5mg/l α-NAA) có khối callus sùi ở gốc rễ to nhất, hầu như không có rễ li ti xen trong khối callus, chiều cao trung bình 2,71(cm), số lá 8,82(lá/chồi).
Ghi chú:
Hình 3.8a: Chồi Dừa cạn ựược nuôi cấy trong môi trường tạo rễ có bổ sung NAA và than hoạt tắnh Hình 3.8b: Chồi Dừa cạn ựược nuôi cấy trong môi trường tạo rễ có bổ sung IBA
Hình 3.8c: Chồi Dừa cạn ựược nuôi cấy trong môi trường tạo rễ có bổ sung kết hợp cả NAA và IBA
Hình 3.8: So sánh sự tạo rễ của 3 môi trường tạo rễ bổ sung chất ựiều tiết sinh trưởng khác nhau
Kết luận: Sau khi làm 3 thắ nghiệm về ảnh hưởng của chất ựiều tiết sinh trưởng ựến sự tạo rễ của chồi Dừa cạn in vitro chúng tôi nhận thấy công thức tốt nhất ựể tạo cây Dừa cạn in vitro hoàn chỉnh là: MS + 1,0mg/l IBA