Chương 2 đỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.2. Phương pháp tiến hành
3.2.2.1. Các phương pháp tiến hành
+ Nội dung 1: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cho cây Dừa cạn.
Quả Dừa cạn ựã chắn in vivo (nhưng chưa tách vỏ) ựược rửa sạch bằng nước cất 1-2 lần rồi tiến hành khử trùng trong buồng cấy vô trùng bằng cách ngâm ngập trong dung dịch khử trùng. Sau ựó tiếp tục tráng lại bằng nước cất vô trùng 3-4 lần rồi tiến hành tách vỏ thu hạt vô trùng. Hạt này ựược cấy vào bình trụ chứa môi trường MS (không bổ sung ựường). Hạt mọc mầm sau 10-14 ngày thì tiến hành cắt ựoạn thân mang mắt ngủ, ựoạn thân không mang mắt ngủ, mô lá ựể tiến hành thắ nghiệm 1-3
Từ thắ nghiệm 4 sử dụng chồi, ựoạn thân có chất lượng tốt (thân mập, lá xanh) ở thắ nghiệm 3 ựể làm vật liệu thắ nghiệm.
+ Nội dung 2: Nghiên cứu xử lý EMS in vitro cây Dừa cạn
* Xử lý ựoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro trong dung dịch EMS
đoạn thân mang mắt ngủ in vitro Dừa cạn ựược cắt thành các mẫu có kắch thước khoảng 1.0cm, lựa chọn mẫu ựồng ựều nhau ựem ngâm vào bình chứa dung dịch EMS ựược pha sẵn nồng ựộ ựã ựịnh. Sau ựó ựem các bình này vào máy lắc trong các khoảng thời gian thắ nghiệm. Các mẫu sau khi xử lý ựem rửa bằng nước cất vô trùng 5 lần và ựược thấm khô bằng giấy thấm vô trùng. Tiếp ựó các mẫu này ựược chuyển nuôi cấy trên môi trường nhân nhanh chồi tối ưu ựã ựược lựa chọn ở thắ nghiệm 3
Dung dịch EMS sau khi dùng xong sẽ ựược xử lý bằng NaOH 1N ựể mất hoạt tắnh trước khi thải ra môi trường (Vũ Hoàng Hiệp, 2008)
* Nuôi cấy ựoạn thân mang mắt ngủ và không mang mắt ngủ của Dừa cạn in vitro trong môi trường có bổ sung EMS
đoạn thân mang mắt ngủ in vitro Dừa cạn ựược cắt thành các mẫu có kắch thước khoảng 1.0cm, lựa chọn mẫu ựồng ựều nhau ựem cấy vào môi trường nhân nhanh tốt nhất có bổ sung các nồng ựộ EMS thắ nghiệm.
đoạn thân không mang mắt ngủ in vitro Dừa cạn ựược cắt thành các mẫu có kắch thước khoảng 0,3 Ờ 0,5cm lựa chọn mẫu ựồng ựều nhau ựem cấy vào môi trường phát sinh hình thái tốt nhất có bổ sung các nồng ựộ EMS thắ nghiệm.
3.2.2.2. điều kiện tiến hành thắ nghiệm
- Phòng nuôi cấy mô có các ựiều kiện sau: + Cường ựộ ánh sáng: 2.000 lux
+ độ ẩm 60% + Nhiệt ựộ 25 ổ 20C
+ Chu kỳ chiếu sáng: (10-12h)/24h - Môi trường nuôi cấy:
+ Sử dụng môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962), pH môi trường chuẩn ựộ trước khi cho agar và khử trùng là 5,7.
+ Lượng agar sử dụng là 6g/l + Lượng sacarose sử dụng 30g/l.
+ Môi trường ựược hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút. + EMS ựược khử trùng bằng màng lọc (Millipore Sterivex GS, 0,22; 1atm)