1.4.1.1. Nghiên cứu phát sinh hình thái
Dhruva và cộng sự (1977) cho thấy việc tái sinh những cây C.roseus khỏe mạnh có thể thực hiện từ những mô sẹo thông qua việc làm lây nhiễm ựoạn thân cây này với 3 loại mycoplasma-like organisms (MLOs) ựược nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng MS rắn (Mollers và Sarkar, 1989). Mô sẹo ựã ựược hình thành trên những mô bị nhiễm, sau ựó mô sẹo chuyển sang môi trường MS có bổ sung α--naphthyl acetic acid (α-NAA) 1,0 mg/l; 6-benzyl aminopurine (BA) 0,25 mg/l và gentamycin 10,0 ml/l. Những cây này sau ựó dễ dàng thắch nghi với ựiều kiện trong nhà kắnh nơi chúng sẽ ựược nuôi trong 1 năm. Việc nhuộm màu lá với fluorochoromes DAPI (4,6- diamidino-2-phenylindole) và berberine sulfate ựã chứng minh sự vắng mặt của MLOs trong cây tái sinh.
Ramavat và cộng sự (1978) ựã mô tả quá trình hình thành chồi non C.roseus từ mô sẹọ Sau ựó sự tái sinh cây từ những tế bào mô sẹo ựơn bội hay lưỡng bội C.roseus
ựược kết hợp với việc sử dụng những chất ựiều hòa sinh trưởng thực vật như kinetin và β-indolylacetic acid (IAA) và ựược thực hiện bởi Abou- Mandour và cộng sự (1979).
Alen và cộng sự (1995) ựã ựề xướng việc nhân giống in vitro dừa cạn bằng cách nuôi dưỡng mô phân sinh ngọn và chồi nách từ những cây ựược nuôi trong nhà kắnh. Các tác giả ựã sử dụng môi trường MS cơ bản có bổ sung BA và 2,4-D ở nồng ựộ thấp, Những chồi nách này sẽ hình thành chồi ngọn sau 4-5 tuần nuôi cấỵ Một phần những chồi này ựã nhân giống ựược chuyển vào nuôi cấy tiếp. Sau ựó
chúng ựược cắt và cho tạo rễ in vitro trong môi trường MS ựược bổ sung với α- NAA và phát triển trong nhà kắnh với ựộ ẩm tương ựối 100%. Trong cả 2 trường hợp ựều thành công.
Andrea Swanberg và Wenhao Dai (2008) ựã nghiên cứu sự phát sinh hệ thống tái sinh in vitro trên hai giống cây dừa cạn Thái Bình Dương Coral (P1) và SunstormRose (P2). Chồi ựược tái sinh từ nuôi cấy mô lá in vitro ựã sử dụng 6- benzyladeine (BA) và α-naphthalene acetic acid (α-NAA).
Bei-Bei Xiang và cộng sự (2010) ựã tiến hành sàng lọc dòng tế bào
Catharanthus roseus ựể sản xuất hàm lượng ajmalicine cao ở cây tứ bội và nhị bộị Mô sẹo dừa cạn ựược hình thành từ cấy lá của cây tứ bội và lưỡng bộị Mô sẹo ựược cảm ứng trong môi trường (MS) Murashige và Skoog bổ sung 0,5 axit α- naphthaleneacetic mg/l (α-NAA), 0,5 mg/l 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid, 2 mg/l 6-benzylaminopurine, 30 sucrose g/l và7,2 g/l môi trường thạch
Ainul Zura Zulkepli và Azman Abd samad (2011) ựã tiến hành nghiên cứu tạo chồi từ lá C.roseus. Thân và cuống lá từ cây trưởng thành của C.roseus ựược ựặt trên MS có bổ sung α-NAA (0,75-1,25 mg/l) và BA (0,25-0,30 mg/l) ựể xác ựịnh loại cấy và nồng ựộ tối ưu ựiều hòa sinh trưởng thực vật ựể tạo chồị Sau 2 tuần nuôi cấy, bắt ựầu callus màu xanh lá cây và trắng ựược hình thành. Tần số cao nhất của sự hình thành mô sẹo ựã ựược thu ựược từ cấy lá tại một sự kết hợp của BA 0,2 mg/l với 1,25 mg/l α-NAẠ Rễ ựược tái tạo từ cuống lá cấy có bổ sung 0,2 mg/l BA với 0,75 mg/l α-NAA ở tuần thứ 8. Lá và thân cấy không gây ra sinh chồi trong môi trường có chứa BA và α-NAẠ
1.4.1.2.Nuôi cấy sinh khối tế bào Dừa cạn ựể thu hợp chất alkaloid
Trước ựây những nguyên liệu thô dùng ựể sản xuất alkaloid thường ựược thu nhận hầu hết tại những vùng mà C.roseus xuất hiện tự nhiên hoặc tại những vùng nó ựược trồng trọt. điều kiện thời tiết và ựặc tắnh của ựất ở một số nước châu Âu thì bất lợi cho việc gieo trồng C.roseus. Vì thế nó chỉ có thể ựược trồng như là một loại cây hàng năm trong nhà kắnh và những nhà mái vòng làm bằng nhựạ Mặt khác,
trong khi nhu cầu về alkaloid rất lớn và giá của chúng rất cao, nhưng hàm lượng alkaloid trong nguyên liệu thô thu nhận từ cây trong tự nhiên là rất thấp. Do ựó, việc thu nhận indole alkaloid từ mô và cơ quan thực vật, và từ những cây ựược nhân giống in vitro là những hướng ựi mới cần ựược phát huỵ Mô sẹo, huyền phù tế bào và rễ tơ ựược nuôi trong bioreactor ựã ựược sử dụng trong nhiều thắ nghiệm. Những mô ựược nuôi cấy từ những cơ quan khác nhau tổng hợp rất nhiều hợp chất thứ cấp và có tắnh di truyền ổn ựịnh. Nhiều triển vọng hứa hẹn bao gồm việc sản xuất những indole alkaloid như : ajmalicine trong mô sẹo, catharanthine trong lá ựược nuôi cấy trong bình lắc và bioreactor có sục khắ và vinblastine từ chồi và rễ tơ.
* Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào
Nhiều nghiên cứu ựã ựược thử nghiệm trong việc thu nhận huyền phù tế bào nuôi cấy cho năng suất thu indole alkaloid cao, ựặc biệt là vinblastine và vincristinẹ Phương pháp sản xuất catharanthine và ajmalicine trong dịch huyền phù ựược nuôi cấy trong bioreactor ựã thành công. Moreno và cộng sự (1996) ựã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất cảm ứng lên những con ựường chuyển hóa khác nhau liên quan ựến quá trình chuyển hóa hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù tế bào
C.roseus.
Dịch trắch tế bào nấm Phytium aphanidermatum ựã ựược tiệt trùng ựược dùng trong nghiên cứu nàỵ Những tế bào C.roseus ngay lập tức biến ựổi quá trình chuyển hóa của chúng ựể phản ứng lại tác ựộng của nấm. Zhao và cộng sự (2001) ựã thử nghiệm nhiều chất cảm ứng của nấm nhận ựược từ 12 loại nấm và ảnh hưởng của chúng lên việc cải thiện sản xuất indole alkaloid ở huyền phù tế bào C.roseus. Những kết quả này cho thấy rằng những chất chiết từ nấm khác nhau kắch thắch tắch lũy những indole alkaloid khác nhau, có thể gấp 2 ựến 5 lần ở nuôi cấy thường.
Zhao và cộng sự (2001) ựã tăng sản phẩm catharanthine trong tế bào nuôi cấy C.roseus bằng cách kết hợp chất cảm ứng nuôi trong bình lắc và bioreactor. Tác ựộng tổng hợp lên sự tắch lũy alkaloid trong tế bào nuôi cấy ựã ựược theo dõi khi chúng ựược xử lý với một vài sự kết hợp giữa chất cảm ứng của nấm và hóa chất.
Sự kết hợp giữa tetramethyl ammonium bromide và nấm sợi Aspergillus niger ựã cho hiệu suất thu ajmalicine cao nhất và cải thiện sự tắch lũy catharanthinẹ Trong khi sự kết hợp giữa chất cảm ứng malate và sodium alginate cho kết quả hiệu suất catharanthine cao nhất và cũng tắch lũy ajmalicine cao trong tế bào nuôi cấỵ Các tác giả sau ựó ựã phát triển quy trình này ựể nâng cao việc sản xuất catharanthine ở tế bào C.roseus nuôi trong bình lắc và bioreactor. Sau 10 ngày nuôi cấy ựã thu ựược catharanthine với hiệu suất theo thứ tự là 25 mg/l, 32 mg/l và 22 mg/l trong bình lắc 500 ml, 1000 ml và bioreactor dạng sục khắ 20 lắt. Tác giả cũng ựã quan sát thấy rằng sự kết hợp giữa việc xử lý malate và alginate kắch thắch sự phản ứng lại, vắ dụ như là sự oxy hóa lipid xảy ra ở hầu hết quá trình nuôi cấy C.roseus và ựiều này có thể gián tiếp sản xuất indole alkaloid thông qua con ựường jasmonatẹ
* Nuôi cấy rễ tơ
Trong những năm gần ựây, phương pháp nuôi cấy rễ, chủ yếu là rễ tơ của
C.roseus ựã tăng lên ựáng kể hơn cả mong ựợi, như là một nguồn tiềm năng của những hợp chất có giá trị chữa bệnh nàỵ Sự phát triển của kỹ thuật vi nhân giống cây và phương pháp ựể mở rộng việc nuôi cấy rễ in vitro là rất quan trọng và có thể trở thành giải pháp quan trọng ựể giải quyết việc thu nhận indole alkaloid từ nguyên liệu thô.
Những yếu tố di truyền của rễ tơ, thu ựược bằng sự nhiễm với
Agrobacterium rhizogenes, sản xuất hợp chất thứ cấp nhiều hơn là những cây tự nhiên. Hàm lượng alkaloid trong rễ tơ có thể tương ựương hoặc cao hơn khi ựối chiếu với hàm lượng ựo ựược trong nghiên cứu ở rễ tự nhiên. Những alkaloid chiếm ưu thế trong rễ tơ là ajmalicine, serpentine, vidoline và catharanthine, ựược tìm thấy với hàm lượng cao hơn trong rễ tự nhiên.