Phƣơng phỏp phổ khối lƣợng là phƣơng phỏp khỏ hiện đại và quan trọng trong việc xỏc định một cỏch định tớnh và định lƣợng thành phần cũng nhƣ cấu trỳc của cỏc hợp chất hoỏ học. Ƣu điểm nổi bật của phƣơng phỏp này là cú độ nhạy cao, cho phộp xỏc định chớnh xỏc phõn tử khối của cỏc hợp chất. Cơ sở của phƣơng phỏp phổ khối lƣợng đối với cỏc chất hữu cơ là sự bắn phỏ cỏc phõn tử hợp chất hữu cơ trung hoà bằng cỏc phõn tử mang năng
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
lƣợng cao để biến chỳng thành cỏc ion phõn tử mang điện tớch dƣơng hoặc phỏ vỡ thành cỏc mảnh ion, cỏc gốc. Tuỳ thuộc vào cấu tạo và tớnh chất của chất nghiờn cứu mà ngƣời ta chọn phƣơng phỏp bắn phỏ và năng lƣợng bắn phỏ thớch hợp.
Hiện nay, trong phƣơng phỏp phổ khối ngƣời ta thƣờng ỏp dụng cỏc phƣơng phỏp ion hoỏ khỏc nhau nhƣ: ion hoỏ hoỏ học (CI), ion hoỏ bằng phƣơng phỏp bụi electron (ESI), bắn phỏ bằng nguyờn tử tăng tốc (FAB), phun mự electron dựng khớ trợ giỳp (PAESI)… Cỏc phƣơng phỏp này đều cú những ƣu và nhƣợc điểm riờng. Tuy nhiờn, trong số cỏc phƣơng phỏp trờn, phƣơng phỏp bụi electron phự hợp nhất và đƣợc sử dụng để nghiờn cứu cỏc phức chất của kim loại. Ƣu điểm của phƣơng phỏp này là năng lƣợng ion hoỏ thấp do đú khụng phỏ vỡ hết cỏc liờn kết phối trớ giữa kim loại và phối tử. Dựa vào phổ khối lƣợng cú thể thu đƣợc cỏc thụng tin khỏc nhau nhƣ: khối lƣợng phõn tử chất nghiờn cứu, cỏc mảnh ion phõn tử, tỉ lệ cỏc pic đồng vị. Từ cỏc thụng tin này cú thể xỏc định đƣợc cụng thức phõn tử của phức chất và cấu tạo của phức chất dựa vào việc giả thiết sơ đồ phõn mảnh.
Cỏc phức chất nghiờn cứu đều chứa cỏc nguyờn tố cú nhiều đồng vị nờn pic ion phõn tử sẽ tồn tại dƣới dạng một cụm pic của cỏc đồng vị, cƣờng độ của mỗi pic đồng vị sẽ tỉ lệ thuận với xỏc suất kết hợp của một bộ cỏc đồng vị của cỏc nguyờn tố cú trong phõn tử. Cƣờng độ tƣơng đối giữa cỏc pic trong cụm pic đồng vị cũng cho ta thụng tin để xỏc nhận thành phần phõn tử hợp chất nghiờn cứu. Muốn vậy, ngƣời ta đƣa ra cụng thức phõn tử giả định của hợp chất nghiờn cứu. Tớnh toỏn lý thuyết cƣờng độ tƣơng đối của cỏc pic đồng vị sau đú so sỏnh với cƣờng độ của cỏc pic trong phổ thực nghiệm để suy ra sự tƣơng quan tỷ lệ cỏc pic đồng vị theo thực tế và theo lý thuyết từ đú khẳng định cụng thức phõn tử phức chất giả định. Việc tớnh toỏn lý thuyết đƣợc thực hiện bằng
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
cỏch sử dụng phần mềm tớnh toỏn Isotope Distribution Calculator online trờn website: http://www.sisweb.com/mstools/isotope.htm
1.5. THĂM Dế HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC PHỐI TỬ VÀ CÁC PHỨC CHẤT
1.5.1. Phƣơng phỏp thử hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm định 1.5.1.1. Hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm định 1.5.1.1. Hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm định đƣợc thực hiện dựa trờn phƣơng phỏp pha loóng đa nồng độ. Đõy là phƣơng phỏp thử hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đỏnh giỏ mức độ khỏng khuẩn mạnh yếu của cỏc mẫu thử thụng qua cỏc giỏ trị thể hiện hoạt tớnh là MIC (Minimum inhibitor concentration - nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (50% inhibitor concentration -
nồng độ ức chế 50%), MBC (Minimum bactericidal concentration - nồng độ
diệt khuẩn tối thiểu).
1.5.1.2. Cỏc chủng vi sinh vật kiểm định
Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gõy bệnh ở ngƣời:
- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thƣờng khụng gõy bệnh.
- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gõy mủ cỏc vết thƣơng, vết bỏng, gõy viờm họng, nhiễm trựng cú mủ trờn da và cỏc cơ quan nội tạng.
- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đƣờng ruột lờn men cú ớch, thƣờng cú mặt trong hệ tiờu hoỏ của ngƣời và động vật.
- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gõy một số bệnh về đƣờng tiờu hoỏ nhƣ viờm dạ dày, viờm đại tràng, viờm ruột, viờm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gõy nhiễm trựng huyết, cỏc nhiễm trựng ở da và niờm mạc, gõy viờm đƣờng tiết niệu, viờm màng nóo, màng trong tim, viờm ruột.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gõy bệnh thƣơng hàn, nhiễm trựng đƣờng ruột ở ngƣời và động vật.
- Candida albicans: là nấm men, thƣờng gõy bệnh tƣa lƣỡi ở trẻ em và cỏc bệnh phụ khoa.
1.5.1.3. Mụi trƣờng nuụi cấy
MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud- 2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm.
1.5.1.4. Cỏch tiến hành
a. Pha loóng mẫu thử:
Mẫu ban đầu đƣợc pha loóng trong DMSO và nƣớc cất tiệt trựng thành một dóy 05 nồng độ hoặc theo yờu cầu và mục đớch thử. Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256g/ml và với chất sạch là 128g/ml.
b. Thử hoạt tớnh
Lấy 10l dung dịch mẫu thử ở cỏc nồng độ vào đĩa 96 giếng, thờm 200l dung dịch vi khuẩn và nấm cú nồng độ 5.105CFU/ml, ủ ở 37o
C/24h.
c. Xử lý kết quả
- Giỏ trị MIC đƣợc xỏc định tại giếng cú nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phỏt triển của vi sinh vật.
- Giỏ trị IC50 đƣợc tớnh toỏn dựa trờn số liệu đo độ đục của mụi trƣờng
nuụi cấy bằng mỏy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. HểA CHẤT, DỤNG CỤ Húa chất 4 - Metyl thiosemicacbazit Isatin NiCl2. 6H2O ZnCl2 CuCl2 PdCl2 Etanol
Dung dịch amoniac loóng
Dung dịch H2SO4 đặc
Dung dịch axit HCl loóng
Nƣớc cất hai lần
Dụng cụ
Mỏy khuấy từ gia nhiệt
Cốc thủy tinh 25ml, 50ml, 100ml
Pipet 1ml, 5ml, 10ml
Bỡnh định mức 50ml, 100ml
Tủ sấy chõn khụng
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Con khuấy từ
Phễu lọc đỏy thủy tinh xốp
Giấy lọc băng xanh
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU VÀ KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM. 2.2.1. Tổng hợp phối tử
Phối tử đƣợc tổng hợp theo sơ đồ chung nhƣ sau:
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tổng hợp phối tử N(4)-metyl thiosemicacbazon Isatin * Tổng hợp phối tử 4 - metyl thiosemicacbazon Isatin (Hmthisa)
Hũa tan 1.05 g (0,01 mol) 4 – metyl thiosemicacbazit vào 15 ml nƣớc đó đƣợc axit húa bằng dung dịch HCl sao cho mụi trƣờng cú pH: 1 – 2, tiếp đến ta hũa tan 1.47 g Isatin vào 15 ml ancol và khuấy ở nhiệt dộ phũng.
Sau đú đổ từ từ 2 dung dịch này vào nhau và khuấy đều hỗn hợp ở nhiệt độ phũng trờn mỏy khuấy từ sẽ thấy chất rắn màu vàng thẫm tỏch ra và tiếp tục khuấy thờm 2 giờ nữa. Chất rắn màu vàng thẫm này đƣợc lọc và rửa nhiều lần bằng nƣớc cất, hỗn hợp rƣợu nƣớc và cuối cựng bằng rƣợu trờn phễu lọc đỏy thuỷ tinh xốp. Làm khụ sản phẩm trong bỡnh hỳt ẩm đến khối lƣợng khụng đổi.phối tử cú thể tan đƣợc trong một số dung mụi nhƣ: Rƣợu, axeton, DMSO. H+ (pH: 1 – 2) O C R1 R2 H2N NH C NH CH3 S N NH C NH CH3 S C R1 R2
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.2. Tổng hợp cỏc phức chất
Cỏc phức chất đƣợc tổng hợp theo sơ đồ sau
pH: 8 -9
Sơ đồ 2.2 : Sơ đồ tổng hợp cỏc chất giữa Pd2+
, Ni2+, Cu2+ và Zn2+ với phối tử N(4)– metyl thiosemicacbazon Isatin(Hmthisa)
*Tổng hợp phức chất của M(II) với Hmthisa: M(mthisa)2
Hỳt 10 ml dung dịch muối MCl2 trong đú (M: pd2+, Ni2+, Cu2+,Zn2+) 0,2M (0,002 mol) cho vào cốc chịu nhiệt loại 100ml, điều chỉnh mụi trƣờng
đến pH khoảng 8 - 9 bằng dung dịch NH3. Cõn 0,937g (0,004 mol) Hmthisa
hoà tan vào 30 ml etanol rồi đun núng nhẹ cho Hmthisa tan hoàn toàn để nguội sau đú đổ hai dung dịch này vào nhau và khuấy đều trờn mỏy khuấy từ ở nhiệt độ phũng sẽ thấy xuất hiện kết tủa màu tƣơng ứng nhƣ bảng 2.1 sau. Giữ nguyờn nhiệt độ và tiếp tục khuấy thờm 2 giờ nữa để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Lọc, rửa kết tủa trờn phễu lọc thuỷ tinh đỏy xốp bằng hỗn hợp rƣợu nƣớc và cuối cựng bằng rƣợu. Làm khụ chất rắn đến khối lƣợng khụng đổi trong bỡnh hỳt ẩm.
Độ tan của cỏc phức chất , màu sắc và dung mụi hũa tan chỳng đƣợc biểu diễn trong bảng.
N NH C NH CH3 S C R1 R2 dd MCl2 (M: Pd2+, Ni2+, Cu2+,Zn2+)
Phức chất của M với cỏc dẫn xuất N(4) – metyl thiosemicacbazon
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.1:Ký hiệu cỏc phức chất, màu sắc và dung mụi hũa tan chỳng
STT Phối tử Phức chất Dung mụi
Hoà tan
Ký hiệu Màu sắc
1 Hmthisa Pd(mthisa)2 Đỏ gạch Axeton,DMF, DMSO, CHCl3…
2 Hmthisa Ni(mthisa)2 Nõu nhạt Axeton,DMF, DMSO, CHCl3…
3 Hmthisa Cu(mthisa)2 Xanh Axeton,DMF, DMSO, CHCl3…
4 Hmthisa Zn(mthisa)2 Vàng Axeton,DMF, DMSO, CHCl3…
2.3. CÁC ĐIỀU KIỆN GHI PHỔ
Phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) của cỏc chất đƣợc ghi trờn mỏy quang phổ FR/IR 08101 trong vựng 4000-400cm-1 của hóng Shimadzu tại Viện Hoỏ Học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Mẫu đƣợc chế tạo theo phƣơng phỏp ộp viờn với KBr.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhõn: 1
H, 13C của cỏc chất đƣợc ghi trờn mỏy Bruker- 500MHz ở 300K, trong dung mụi d6-DMSO và CDCl3, tại Viện Hoỏ học - Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
Phổ khối lƣợng của cỏc phức chất đƣợc ghi trờn mỏy LC-MSD-Trap-SL tại Phũng cấu trỳc, Viện Hoỏ học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam trong điều kiện nhƣ sau: vựng đo m/z : 50 - 2000; ỏp suất phun mự 30 psi; tốc độ khớ làm khụ 8 lớt/phỳt; to
làm khụ 325oC; tốc độ thổi khớ 0,4ml/phỳt; chế độ đo possitive, theo phƣơng phỏp ESI
2.4. PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG CÁC NGUYấN TỐ TRONG
PHỨCCHẤT
Để phõn tớch hàm lƣợng cỏc kim loại trong phức chất chỳng ta đều vụ cơ húa mẫu nhƣ sau.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Cõn một lƣợng chớnh xỏc mo gam mẫu trong khoảng 0,03 đến 0,05 gam, chuyển vào bỡnh Kendan. Thấm ƣớt mẫu bằng vài giọt H2SO4 đặc rồi nhỏ vào đú 2ml dung dịch H2O2 30%, đun trờn bếp điện cho tới khi cú khúi trắng thoỏt ra. Lặp lại cụng đoạn thờm H2O2 và đun núng cho tới khi nào tan hết và thu đƣợc dung dịch trong suốt cú màu tƣơng ứng với của ion kim loại,
2.4.1. Phõn tớch hàm lƣợng palađi trong phức chất.
Để xỏc định hàm lƣợng của palađi trong phức chất chỳng tụi sử dụng phƣơng phỏp phõn tớch trọng lƣợng bằng cỏch kết tủa palađi(II) với đimetylglyoxim. Cỏch tiến hành cụ thể nhƣ sau:
Cân một l-ợng chính xác mo gam mẫu trong khoảng 0,03 ữ 0,05 gam, chuyển vào bình Kendan. Thấm -ớt mẫu bằng vài giọt H2SO4 đặc rồi đun trên bếp điện cho tới khi mẫu tan hết. Để nguội một ít, rồi nhỏ vào đó 2ml dung dịch H2O2 30%, tiếp tục đun cho tới khi có khói trắng thoát ra. Lặp lại công đoạn nh- vậy cho tới khi thu đ-ợc dung dịch trong suốt có màu vàng nhạt đối với phức của Pd(II).
Để nguội dung dịch thu đƣợc, sau đú chuyển vào cốc và pha loóng thành 50ml. Chỉnh mụi trƣờng bằng dung dịch NH3 loóng cho tới khi pH = 2 - 4. Thờm vào đú từng giọt dung dịch đimetylglyoxim (1,5% trong etanol) tới khi khụng thấy kết tủa mới xuất hiện, thờm tiếp 5ml nữa để đảm
bảo dƣ đimetylglyoxim. Kết tủa đ-ợc để lắng qua đêm sau đó lọc bằng phễu
lọc thuỷ tinh xốp (có khối l-ợng ban đầu m1 gam (sau khi sấy ở 120o trong 10 giờ)). Sau đó sấy phễu chất ở 120o (trong 10 giờ). Cân tổng khối l-ợng phễu lọc và kết tủa (m2 gam). Từ đây ta tính đ-ợc l-ợng Pd có trong mẫu ban đầu lần l-ợt theo công thức: % ( ) 0.316 100% 0 1 2 m m m mPd
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
trong đú giỏ trị 0,316 là hàm lƣợng % theo khối lƣợng của palađi trong phức chất của nú với đimetylglyoxim.
2.4.2. Phõn tớch hàm lƣợng niken trong phức chất
Để xỏc định hàm lƣợng Ni(II) trong phức chất chỳng tụi tiến hành vụ cơ húa mẫu sau đú sử dụng phƣơng phỏp chuẩn độ complexon.
+ Qui trỡnh cụ thể:
Để nguội dung dịch thu đƣợc, sau đú chuyển vào bỡnh định mức 50ml, rồi pha nƣớc tới vạch mức. Hỳt 10ml dung dịch Ni(II) vào bỡnh nún 100ml thờm ớt chỉ thị murexit, điều chỉnh mụi trƣờng bằng dung dịch NH3 loóng tới khi pH = 8 (dung dịch vàng nhạt) rồi chuẩn độ bằng EDTA nồng độ C mol/l tới khi dung dịch chuyển sang màu tớm (hết V ml EDTA). Hàm lƣợng Ni(II) trong mẫu đƣợc tớnh theo cụng thức sau:
%mNi= V x C x 58 50 10 1000 x mo x 100 % 2.4.3. Phõn tớch hàm lƣợng đồng trong phức chất
Để xỏc định hàm lƣợng Cu(II) trong phức chất chỳng tụi tiến hành vụ cơ húa mẫu sau đú sử dụng phƣơng phỏp chuẩn độ complexon.
+ Qui trỡnh cụ thể:
Để nguội dung dịch thu đƣợc, sau đú chuyển vào bỡnh định mức 50ml, rồi pha nƣớc tới vạch mức. Hỳt 10ml dung dịch Cu(II) vào bỡnh nún 100ml thờm ớt chỉ thị murexit, điều chỉnh mụi trƣờng bằng dung dịch NH3 loóng tới khi pH = 8 (dung dịch cú màu vàng nhạt) rồi chuẩn độ bằng EDTA nồng độ C mol/l tới khi dung dịch chuyển sang màu tớm (hết V ml EDTA). Hàm lƣợng Cu(II) trong mẫu đƣợc tớnh theo cụng thức sau:
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn %mCu= V x C x 64 50 10 1000 x mo x 100 % 2.4.4. Phõn tớch hàm lƣợng kẽm trong phức chất
Để xỏc định hàm lƣợng Zn(II) trong phức chất chỳng tụi tiến hành vụ cơ húa mẫu sau đú sử dụng phƣơng phỏp chuẩn độ complexon.
+ Qui trỡnh cụ thể:
Để nguội dung dịch thu đƣợc, sau đú chuyển vào bỡnh định mức 50ml, rồi pha nƣớc tới vạch mức. Hỳt 10ml dung dịch Zn(II) vào bỡnh nún 100ml thờm ớt chỉ thị ET-OO, điều chỉnh mụi trƣờng bằng dung dịch NH3 loóng tới khi pH =10 (dung dịch cú màu đỏ nho) rồi chuẩn độ bằng EDTA nồng độ C mol/l tới khi dung dịch chuyển sang màu xanh biếc (hết V ml EDTA). Hàm lƣợng Zn(II) trong mẫu đƣợc tớnh theo cụng thức sau:
%mZn = V x C x 65 50 10 1000 x mo x 100 %
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG ION KIM LOẠI TRONG CÁC
PHỨCCHẤT
Sau khi tiến hành phõn tớch hàm lƣợng ion kim loại trong phức chất và bằng cỏch tớnh toỏn theo cụng thức giả định chỳng tụi thu đƣợc bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả phõn tớch hàm lượng ion kim loại trong cỏc phức chất
STT Phức chất Hàm lƣợng ion kim loại Cụng thức giả định
LT(%) TN(%)
1 Pd(mthisa)2 18,61 18.55 C20H18N8O2S2Pd
2 Ni(mthisa)2 10.87 10.61 C20H18N8O2S2Ni
3 Cu(mthisa)2 11.85 11.81 C20H18N8O2S2Cu
4 Zn(mthisa)2 12.0 11.8 C20H18N8O2S2Zn
Kết quả phõn tớch hàm lƣợng của cỏc kim loại trong phức thức theo cụng thức giả định và theo thực tế khỏ phự hợp nhau. Để khẳng định cụng thức giả định của cỏc phức chất và xỏc định cụng thức cấu tạo của cỏc phức chất chỳng tụi tiếp tục nghiờn cứu phối tử và phức chất bằng cỏc phƣơng phỏp vật lý hiện đại khỏc.
3.2.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PHỔ KHỐI LƢỢNG CỦA CÁC PHỨC CHẤT 3.2.1. Kết quả phõn tớch phổ khối lƣợng của phức chất Pd(mthisa)2