1.3. QÚA TRÌNH LÊN MEN RƯỢU ETHANOL VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG
1.3.1. Quá trình lên men rượu ethanol
Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau. Tuy nhiên có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí (kị khí) và lên men hiếu khí.
Lên men rượu là quá trình hô hấp kị khí, trong đó đường bị phân thành rượu ethanol và CO2 dưới tác dụng của vi sinh vật, đặc biệt là nấm men.
Phương trình phản ứng tổng quát:
C6H12O6 nấm men 2C2H5OH + 2CO2 + 113,4 KJ 1.3.1.1. Các giai đoạn lên men rượu [28], [47]
Có thể chia quá trình lên men rượu thành 2 giai đoạn:
Giai đoạn tăng sinh khối nấm men: giai đoạn này nấm men nảy chồi và phát triển mạnh để tăng sinh khối vì trong môi trường đầy đủ chất dinh dưỡng và có mặt của oxy.
Giai đoạn lên men: Khi thiếu oxy, nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống biến đổi đường thành rượu, CO2 và sản phẩm phụ là glyceryl, acid succinic, một số aldehyde, rượu cao phân tử,…. Quá trình này thực chất rất phức tạp, gồm nhiều phản ứng hóa học liên tiếp để tạo thành ethanol [28], [47].
+ Quá trình phân giải yếm khí bắt đầu từ phosphorin hóa đường. Dưới tác dụng của enzyme hexokinase, một nhóm phosphat của ATP được xúc tác chuyển đến glucose và tạo thành glucose-6-phosphat.
+ Dưới tác dụng của glucosephosphatisomerase sẽ chuyển glucose-6-phosphat thành fructose-6-phosphat.
+ Tiếp đến giai đoạn phosphorin hóa mới, dưới tác dụng của enzyme phosphofructokinase cơ chất fructose-6-phosphat được chuyển hóa thành fructose - 1,6-diphosphat.
+ Tiếp đến giai đoạn phân hủy fructose-1,6-diphosphat dưới tác dụng của enzyme aldolase thành hai phân tử phosphotrimose là: phosphoglyceraldehyd (PGA) và phosphodihydroxyaceton (PDA).
+ Giai đoạn đồng phân hóa, dưới tác dụng của enzyme triophosphatisomerase, các phân tử phosphodihydroxyaceton được chuyển hóa thành phosphoglyceraldehyde.
Sự cân bằng này đạt được khi lượng phosphoglyceraldehyde đạt 95% và phosphodihydroxyaceton đạt 5%.
+ Giai đoạn oxy hóa khử, sử dụng phân glyceraldehyde-3-phosphat đóng vai trò quan trọng. Sản phẩm thường được dùng cho những phản ứng sau nên các quá trình này chia theo một hướng nhất định.
Dưới tác dụng của enzyme glyceraldehyde phosphatdehydrogenase, glyceraldehyd- 3-phosphat bị oxy hóa và phosphorin hóa để tạo thành acid-1,3-diphosphoglyceric.
+ Giai đoạn tạo thành ATP và acid 3-phosphoglyceric. Giai đoạn này được xúc tác của enzyme phosphoglycerickinase.
Năng lượng được giải phóng ra trong phản ứng này lập tức được dự trữ trong ATP do phosphat chưa liên kết cao năng được chuyển từ acid-1,3-diphosphoglyceric đến ADP và tạo thành ATP.
+ Giai đoạn tiếp theo, acid 3-phosphoglyceric được chuyển hoá thành acid 2- phosphoglyceric.
+ Giai đoạn tạo thành acid phosphoenolpyruvic (PEP) như enzyme enolase. Do mất một phân tử nước nên acid 2-phosphoglyceric phân bố lại năng lượng nội phân tử và chuyển hoá thành acid phosphoenolpyruvic này chưa liên kết cao năng.
+ Tạo thành ATP và enolpyruvic.
Dưới tác dụng của phosphotransferase (hay pyruvatphosphokinase) gốc acid phosphoric có liên kêt cao năng, được chuyển từ acid phosphoenolpyruvic đến ADP và tạo thành ATP và acid enolpyruvic.
+ Sự tạo thành acid enolpyruvic là hợp chất không bền vững và sẽ chuyển thành acid pyruvic bền vững hơn.
+ Dưới tác dụng của enzyme pyruvat decarboxylase phân tử acid pyruvic sẽ bị khử CO2 và tạo thành acetaldehyde.
+ Sau đó acetaldehyde được khử thành ethanol dưới tác dụng của enzyme alcohol dehydrogenase.
1.3.1.2. Sự tạo thành các sản phẩm phụ trong quá trình lên men rượu ethanol Trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm chính là ethanol và CO2 còn tạo ra nhiều chất khác. Bằng phân tích sắc kí người ta phát hiện trên 50 chất khác nhau, nhưng có thể xếp thành 4 nhóm chính: acid, ester, aldehyde và alcol cao phân tử.
* Sự tạo thành acid
Trong quá trình lên men rượu, luôn luôn có sự tạo thành các acid hữu cơ: acetic, lactic, citric, pyrovic và succinic nhưng nhiều nhất là acetic và lactic.
Acid acetic có thể được tạo thành từ phản ứng oxy hoá khử giữa hai aldehyde acetic:
CH3CHO + CH3CHO + H2O = CH3COOH + C2H5OH
Acid lactic được tạo thành bởi pyruvat dehydronase theo phản ứng:
CH3CO – COOH + NAD.H2 = CH3CHOHCOOH + NAD Hoặc
CH2O(H2PO3)CHOHCHO + H2O = CH3CHOHCOOH + H3PO4
Glycerine và aldehyde đều là sản phẩm trung gian của lên men rượu.
Trong điều kiện lên men nhằm mục đích chỉ thu ethanol, người ta khống chế pH của dịch lên men trong giới hạn 4,5 ÷ 5,2. Với điều kiện ấy lượng glycerin tạo thành chỉ chiếm 0,3 ÷ 0,45% dịch sau lên men.
Glycerine chỉ được tạo thành trong giai đọan cảm ứng khi mà lượng acetaldehyde tạo thành còn ít, hydro từ NADH2 được chuyển đến glyceraldehyde-3-phosphat để tạo thành glycerin-3-phosphat. Sau dó glycerin-3-phosphat bị mất gốc phosphat và tạo thành glycerin.
Nếu tăng pH tới kiềm thì lượng glycerin tạo thành tăng tới 23,4% [5]. Trong điều kiện này thì acetaldehyde không bị khử thành ethanol như trước. Khi dó, chất nhận hydro từ NADH2 là dihydroxyacetonphosphat và kết quả cuối cùng là tạo thành glycerin theo phản ứng:
* Sự tạo thành alcol cao phân tử
Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men rượu là các rượu có số nguyên tử carbon lớn hơn hai. Các rượu này tuy ít nhưng nếu có lẫn vào sản phẩm sẽ gây những ảnh hưởng xấu tới chất lượng sản phẩm. Đó là các rượu propylic, izobutylic,… Hàm lượng của chúng chỉ chiếm khoảng 0,4 ÷ 0,5%
so với cồn etylic nhưng gây cho sản phẩm có mùi hôi khó chịu.
Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng, sự tạo thành alcol cao phân tử chỉ phụ thuộc vào cấu trúc và hàm lượng acid amin có trong dịch lên men. Theo giáo sư Vexelop, việc tạo thành alcol cao phân tử xuất hiện chủ yếu trong giai đoạn sinh trưởng của nấm men. Trong giới hạn pH từ 3,0 ÷ 5,0, alcol cao phân tử tích tụ trong dịch lên men sẽ nhiều hơn, nhưng nếu tiếp tục tăng pH thì hàm lượng alcol cao phân tử sẽ giảm. Sục khí vào dịch lên men sẽ làm tăng sự tạo thành alcol cao phân tử, bổ sung acid amin vào dịch lên men cũng làm tăng hàm lượng alcol cao phân tử [7].
* Sự tạo thành ester
Song song với việc tạo ra acid và rượu, dưới tác dụng của enzyme esterase của nấm men, các acid và rượu sẽ tác dụng lẫn nhau để tạo thành những ester tương ứng:
R1CH2OH + R2COOH R2COO-CH2R1 + H2O
Sự tạo thành ester sẽ xảy ra dễ dàng hơn khi các cấu tử tham gia phản ứng là các aldehyde:
R1CHO + R2CHO R1COO-CH2R2
Hàm lượng ester càng nhiều thì rượu càng thơm ngon. Trong quá trình lên men hàm lượng ester được tạo ra còn phụ thuộc vào giống men cũng như khả năng sinh trưởng, tạo khối nấm men.
* Sự tạo thành acetoin, diacetyl và 2,3 butadiol
Ba hợp chất này được tạo thành trong công đoạn lên men chính bởi hoạt động sống của tế bào nấm men. Trong ba chất này độc hại và nguy hiểm nhất là diacetyl, đây là chất lỏng không màu đến màu vàng nhạt, có mùi hôi cực mạnh, vị đắng gắt rất khó chịu, tác động mạnh đến hệ thần kinh con người. Nếu xem acid pyruvic là điểm xuất phát thì cơ chế tạo thành ba chất này như sau:
CH3-CO-COOH CH3-CHO + CO2
Acid pyruvic acetaldehyde
CH3-CHO + CH3-CHO CH3-CO-CHOH-CH3 Acetaldehyde acetoin
CH3-CO-CHOH-CH3 2H CH3-CHOH-CHOH-CH3 -2H 2,3 Butanol
CH3-CO-CHOH-CH3 2H CH3-CO-CO-CH3 +2H Diacetyl
* Sự tạo thành aldehyde
Aldehyde là sản phẩm được tạo thành trong quá trình trao đổi chất của nấm men cũng có thể được tạo thành qua con đường oxy hóa rượu. Trong quá trình lên men hàm lượng acetaldehyde chiếm cao nhất (xấp xỉ 90 mg/l). Tổng lượng aldehyde trong rượu dao động từ 35 ÷ 150mg/l, ở điều kiện yếm khí lượng acetaldehyde tạo thành ít hơn so với điều kiện hiếu khí. Ở lượng vừa phải, aldehyde làm tăng thêm hương cho rượu nhưng nếu nhiều quá thì chúng làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng rượu vang.
Trong giai đoạn lên men phụ hàm lượng aldehyde giảm đi rất nhiều.
Cụ thể như sau:
2H+ + CH3CHO CH3CH2OH