1.3.1. Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp proline chống chịu tốt với điều kiện môi trường bất lợi
Các nhà khoa học đã phân lập đƣợc các gen: P5CS, P5CR, P2CR, α-OAT, v.v. mã hóa cho các enzyme tham gia vào chu trình sinh tổng hợp proline. Các gen này đã đƣợc thiết kế với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng. Các cây trồng biến đổi các gen này đã đƣợc chứng minh là tăng cường được khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường. Thuốc lá là loài cây đầu tiên được chuyển gen P5CS phân lập từ cây nho đƣợc điều khiển bởi promoter 35S. Phân tích các dòng thuốc lá chuyển gen này cho thấy hoạt động của enzyme P5CS rất mạnh và hàm lƣợng proline tích lũy
tăng lên từ 10 - 18 lần so với cây đối chứng không chuyển gen. Tăng cường tích lũy proline ở các dòng thuốc lá này còn kích thích sự phát triển của sinh khối rễ khi cây bị xử lý mặn. Do hàm lƣợng proline tăng lên rất mạnh ở các dòng thuốc lá chuyển gen nên kết quả này cho thấy hoạt tính của enzyme P5CS giữ vai trò quyết định trong chu trình sinh tổng hợp proline ở thực vật. Đặc biệt hơn, khi bổ sung thêm nitơ vào môi trường nuôi cấy các dòng thuốc lá này thì hàm lượng proline tăng lên đáng kể so với dòng thuốc lá chuyển gen nuôi trên môi trường không đƣợc bổ sung nitơ (Kavi Kishor et al., 1995). Những nghiên cứu về enzyme P5CS tinh sạch từ cây đậu xanh cũng cho thấy enzyme này bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng ức chế phản hồi ngƣợc của proline và hoạt tính của enzyme này giảm tới 50% khi bổ sung 5mM proline ngoại bào (Hu et al., 1992). Bên cạnh đó, nitơ đóng vai trò nhƣ là cơ chất và cũng là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi proline và cũng giữ chức năng điều hòa hoạt động của proline.
Nghiên cứu trên cây Arabidopsis các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc mối quan hệ chặt chẽ giữa hoạt động của enzyme P5CS và sự tích lũy proline trong điều kiện cây bị stress về thẩm thấu (Savouré et al., 1995); Sự xuất hiện hiệu ứng ức chế phản hồi ngƣợc của proline tới hoạt tính của enzyme P5CS cũng bị ảnh hưởng dưới các điều kiện bất lợi của môi trường. Khi chuyển gen P5CS đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi ngƣợc (feedback inhibition) bởi proline vào cây thuốc lá, kết quả các dòng thuốc lá chuyển gen P5CS đột biến tăng cường tích lũy proline nhiều hơn gấp 2 lần so với các dòng thuốc lá chuyển gen P5CS kiểu dại (gen P5CS không đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi ngƣợc) tách từ cây V. aconitifolia (Kavi Kishor et al., 1995; Zhang et al., 1995).
Thêm vào đó, khi xử lý các dòng thuốc lá chuyển gen P5CS đột biến với 200mM NaCl thì kích thích sự tích lũy proline. Tương tự, loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngược đối với enzyme P5CS, Nguyễn Thị Thúy Hường và đtg (2010) đã chứng minh cây thuốc lá chuyển gen P5CS đột biến dưới sự điều khiển của promoter rd29A chống chịu tốt hơn rõ rệt so với cây không chuyển gen ở điều kiện gây hạn nhân tạo. Phân tích hàm lƣợng proline cho thấy các dòng thuốc lá chuyển
gen P5CS đột biến tích lũy proline ở mức độ cao hơn hẳn so với cây đối chứng không chuyển gen. Những kết quả này là dẫn chứng rất rõ ràng rằng hiệu ứng ức chế phản hồi ngƣợc enzyme P5CS bởi proline giữ vai trò rất quan trọng đối với quá trình sinh tổng hợp proline của thực vật trong cả điều kiện bình thường và điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu.
Ở các loài thực vật tổng hợp mạnh proline thì cây có tính chống chịu tốt hơn so với các loài thực vật khác trong các điều kiện môi trường bị hạn và mặn (Kavi Kishor et al., 1995). Cây lúa chuyển gen P5CS phân lập từ cây đậu có tính kháng mặn tốt hơn hẳn các dòng lúa đối chứng không chuyển gen (Zhu et al., 1998). Tương tự, khi các nhà khoa học tiến hành chuyển trực tiếp gen P5CS vào hạt phấn của của cây lúa mì và tiến hành kiểm tra tính kháng trong điều kiện mặn thì cũng cho thấy các kết quả tương tự như ở cây lúa mì (Sawahel & Hassan, 2002). Thêm vào đó, ở cây carot chuyển gen P5CS cho thấy các dòng tế bào carot chuyển gen có tính kháng muối cao hơn tới 6 lần so với dòng đối chứng không chuyển gen (Han et al., 2003), cây ôliu (Olea europaea) chuyển gen P5CS tích lũy proline cao ở điều kiện môi trường mặn 200mM NaCl (Behelgardy et al., 2012). Những kết quả này không chỉ đƣợc chứng minh ở thực vật bậc cao mà còn cả ở loài vi tảo Chlamydomonas reinhardtii khi đƣợc chuyển gen P5CS. Các dòng vi tảo chuyển gen tích lũy proline cao hơn 80% so với các dòng không chuyển gen. Những dòng chuyển gen này sinh trưởng nhanh hơn trong mụi trường cú chứa 100 àM cadmium và khả năng tớch lũy cadmium cao hơn tới 4 lần so với dòng hoang dại không chuyển gen (Siripornadulsil et al., 2002). Gần đây, gen P5CS phân lập thành công từ cây lúa và khi đƣợc chuyển trở lại vào cây lúa nhằm tăng cường hoạt động của gen này, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng tính chịu mặn và chịu lạnh đƣợc cải thiện rõ rệt (Hong et al., 2000; Hur et al., 2004).
Bảng 1.1: Một số loài cây trồng chuyển gen mã hóa các enzyme tham gia sinh tổng hợp proline, chống chịu tốt với điều kiện môi trường bất lợi.
Loài cây Gen chuyển Khả năng chống chịu bất lợi