Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.3. TẠO CÁC DÒNG CÂY XOAN TA CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC
3.3.1. Tạo dòng cây Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSm
Gen P5CSm dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng hạn rd29A được chuyển vào đoạn thân mầm Xoan ta thông qua A. tumefaciens. Các dòng chồi chuyển gen được tái sinh trên môi trường chọn lọc SSM (MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin + 150 mg/l kanamycin + 300 mg/l cefotaxime + 30 g/l sucrose + 8,0 g/l agar) và cho ra rễ trên môi trường chọn lọc PSM (MS + 0,3 mg/l IBA + 50 mg/l kanamycin + 30 g/l sucrose + 8,0 g/l agar). Chỉ có những cây mang cấu trúc gen chuyển mới có thể sống và ra rễ. Với 3 lô thí nghiệm chuyển cấu trúc gen rd29A::P5CSm vào Xoan ta thu được 72 dòng cây Xoan ta ra rễ trên môi trường chọn lọc (bảng 3.9). Các dòng cây Xoan ta này được chuyển ra trồng trong nhà lưới.
Khi cây sinh trưởng bình thường (ra lá mới), lá của 72 dòng cây Xoan ta chuyển gen và dòng cây đối chứng không chuyển gen (WT) đƣợc thu và tách chiết DNA tổng số, sử dụng cho sàng lọc bằng PCR. Kết quả cho thấy, cả 72 dòng cây Xoan ta kiểm tra đều dương tính với phản ứng PCR, các dòng chuyển gen đều xuất hiện một băng DNA có kích thước 1,29 kb đúng với kích thước của đoạn promoter rd29A.
Điều này chứng tỏ các dòng Xoan ta này đã đƣợc chuyển cấu trúc gen rd29A::P5CSm.
Bảng 3.9: Kết quả tạo dòng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm Lô thí
nghiệm
Số mẫu biến nạp
Số chồi tái sinh/môi trường
SSM
Số chồi ra rễ/ môi trường R
Tổng chồi ra rễ (PCR +)
1 200 113 28
2 150 68 24 72
3 150 75 20
Hình 3.8: Các dòng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm.
a và b: chồi Xoan ta chuyển gen tái sinh trên môi trường có 150 mg/l kanamycin; c:
chồi Xoan ta chuyển gen ra rễ trên môi trường có 50 mg/l kanamycin; d: các dòng Xoan ta chuyển gen trồng ở nhà lưới 1 tháng tuổi.
3.3.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm Các dòng cây Xoan ta chuyển gen dương tính với PCR trồng trong bầu đất 1 tháng tuổi được xử lý bởi hạn nhân tạo (không tưới nước). Sau 10 ngày xử lý bởi hạn nhân tạo, các dòng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm và dòng cây đối chứng có phản ứng khác nhau với điều kiện hạn; Trong 72 dòng cây Xoan ta chuyển gen thu đƣợc 2 dòng có khả năng chịu hạn tốt nhất (dòng có ký hiệu: PX24 và PX30) so với các dòng chuyển gen khác và đối chứng cây không chuyển gen (WT). Hai dòng Xoan ta PX24 và PX30 sinh trưởng và phát triển bình thường, ngược lại các dòng
a b
c d
Xoan ta chuyển gen còn lại và đối chứng không chuyển gen lá bị héo rủ, rụng và ngừng sinh trưởng sau 10 ngày xử lý bởi hạn nhân tạo. Các dòng cây Xoan ta chuyển gen có mức độ chống chịu khô hạn khác nhau, điều này có thể do khả năng biểu hiện của gen biến nạp và phụ thuộc vào vị trí chèn vào hệ gen vật chủ hoặc số lƣợng bản sao của gen biến nạp.
Hình 3.9: Các dòng Xoan ta chuyển gen P5CSm và dòng WT sau xử lý bởi hạn nhân tạo 10 ngày (không tưới nước).
Các dòng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm khi sống trong điều kiện môi trường bị khô hạn sẽ tăng cường sinh tổng hợp proline, giúp tăng cường áp suất thẩm thấu của tế bào. Để biết đƣợc chi tiết hơn, các mẫu lá của 3 dòng Xoan ta chuyển gen (PX24, PX30 và PX13) và dòng đối chứng (WT) đã được thu trước và sau xử lý bởi hạn nhân tạo ở các khoảng thời gian 4, 6, 8 và 10 ngày. Các mẫu lá đƣợc tách chiết và xác định hàm lƣợng proline. Kết quả thu đƣợc cho thấy, sau khi xử lý bởi hạn nhân tạo, các mẫu lá có hàm lượng proline tăng rất mạnh so với trước xử lý hạn ở cả 4 dòng cây Xoan ta đƣợc phân tích, đặc biệt ở các dòng Xoan ta chuyển. Sau 10 ngày xử lý bởi hạn nhân tạo, hàm lƣợng proline ở dòng cây đối chứng không chuyển gen tăng lên 1,89 lần (tương ứng tăng từ 0,247 lên 0,468 mg/g lá tươi) so với trước xử lý hạn, trong khi đó các dòng cây chuyển gen tăng 3,04 – 5,79 lần (cao nhất ở dòng PX24 tăng từ 0,318 lên 1,842 mg/g lá tươi và thấp nhất ở dòng PX13 tăng từ 0,279 lên 0,850 mg/g lá tươi) (bảng 3.10 và hình 3.10). Kết quả
WT
này hoàn toàn phù hợp với sự biểu hiện về hình thái, về khả năng chống chịu khô hạn của các dòng Xoan ta chuyển gen và dòng WT sau 10 ngày không tưới nước (hình 3.12).
Bảng 3.10: Hàm lƣợng proline tích lũy trong các dòng Xoan ta chuyển gen và đối chứng khi xử lý bởi hạn nhân tạo
Dòng Xoan ta
Hàm lượng proline (mg/g lá tươi) Tỉ tệ (%) tăng sau 10 ngày xử lý (H10)
so với trước xử lý (TH)
TH H4 H6 H8 H10
WT 0,247 0,311 0,355 0,461 0,468 189,474
PX13 0,279 0,471 0,577 0,650 0,850 304,659
PX24 0,318 0,85 0,963 1,366 1,842 579,245
PX30 0,306 0,718 0,881 1,320 1,737 567,647
Hình 3.10: Hàm lƣợng proline tính lũy trong các khoảng thời gian gây hạn nhân tạo.
Ghi chú: TH: trước xử lý hạn; H4, H6, H8 và H10: thời gian gây hạn 4, 6, 8 và 10 ngày; WT: cây không chuyển gen; PX13, PX24, PX30: dòng chuyển gen P5CSm.
Hình 3.11: Sản phẩm RT-PCR từ mRNA của các dòng Xoan ta chuyển gen và đối chứng.
PX13, PX24, PX30 là dòng chuyển gen; WT là dòng đối chứng không chuyển gen: + đối chứng dương chạy từ mẫu plasmid pBI101:: P5CSm.
+ PX13 PX24 PX30
WT
Để đánh giá mức độ biểu hiện phiên mã của gen P5CSm, chúng tôi đã tiến hành tách chiết mRNA của 3 dòng Xoan ta chuyển gen và 1 dòng đối chứng (WT) làm khuôn cho phản RT-PCR. Kết quả cả 3 dòng chuyển gen đều dương tính với phản ứng RT-PCR, xuất hiện một bằng DNA kích thước khoảng 1100 bp đúng với kích thước lý thuyết của cặp mồi, còn dòng WT âm tính (Hình 3.11).
Hình 3.12: Biểu hiện hình thái của các dòng Xoan ta chuyển gen và dòng WT trước và sau xử lý hạn 10 ngày. Hình a trước xử lý hạn; hình b sau 10 ngày xử lý hạn; PX30, PX24 và
PX13 là các dòng cây Xoan ta chuyển gen; WT dòng cây đối chứng không chuyển gen.
Kết quả nghiên cứu thu đƣợc cho thấy, đã chuyển thành công gen P5CSm mã hóa cho enzyme pyrroline 5-carboxylate synthetase dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng hạn rd29A vào cây Xoan ta. Xử lý hạn nhân tạo 72 dòng cây Xoan ta chuyển gen thu đƣợc 2 dòng PX24 và PX30 có khả năng chống chịu tốt với điều kiện khô hạn. Đây sẽ là cơ sở để ứng dụng công nghệ chuyển gen trong tạo giống cây lâm nghiệp nói chung và cây Xoan ta nói riêng chống chịu tốt điều kiện môi trường khô hạn.
PX24 3a
PX30 PX13 WT
PX24
PX30 PX13 WT
b a