Với những hiểu biết sâu sắc về con đường sinh tổng hợp GB ở sinh vật, cùng với sự phát triển mãnh mẽ của lĩnh vực công nghệ gen, đặc biệt là kỹ thuật tạo cây trồng biến đổi gen. Các nhà khoa học đã phân lập đƣợc các gen: codA (COD), COX, BADH, betA (CDH), CMO, GSMT và SDMT từ nhiều nguồn khác nhau, mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp GB. Các gen này đã đƣợc thiết kế với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng, các loài cây trồng biến đổi các gen đã đƣợc phân tích có sự tích lũy GB dẫn
đến tăng cường được khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường như mặn muối, khô hạn, lạnh, băng giá, nhiệt độ cao và tác nhân oxy hóa.
1.3.2.1. Cây trồng chuyển gen tổng hợp glycine betaine tăng cường khả năng chống chịu mặn muối
Độ mặn cao gây ra sự mất cân bằng ion, gây độc hại cho tế bào chất và tăng áp lực thẩm thấu của tế bào (Ward et al., 2003). Thực vật đã phát triển thành hai loại khác nhau liên quan đến các cơ chế để ứng phó với điều kiện môi trường mặn muối.
Cây chịu mặn tích lũy muối dƣ thừa trong các không bào, kiểm soát nồng độ muối trong tế bào chất và duy trì một tỷ lệ K+/Na+ trong các tế bào chất (Glenn et al., 1999). Trong khi đó, các cây nhạy cảm với muối, tích tụ các chất hoà tan tương thích, giúp hạn chế sự hấp thu muối và điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào. Trong nhiều loài thực vật, GB đƣợc tích lũy khi phản ứng với stress muối (Rathinasbapathi et al., 2001). Nghiên cứu sinh lý học đã chứng minh rằng mức độ tích lũy GB tương quan với mức độ chịu mặn (Saneoka et al., 1995). Các nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng, sử dụng GB ngoại sinh cũng gia tăng khả năng chịu mặn ở một số loài cây không có khả năng tích lũy GB (Hayashi et al., 1998). Trong vài năm gần đây, một số loài thực vật đã được chuyển các gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp GB (Bảng 1.2). Mặc dù sự tích lũy GB thấp, nhƣng các cây trồng chuyển gen cho thấy đã cải thiện đƣợc khả năng chống chịu với điều kiện stress muối (Sakamoto & Murata, 2002). Ví dụ, Arabidopsis chuyển gen codA tăng cường khả năng chịu muối trong quá trình nảy mầm hạt giống và các giai đoạn sinh trưởng, phát triển tiếp theo của cây (Hayashi et al., 1997). Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy ở cây thuốc lá chuyển gen CDH, mặc dự mức độ tớch lũy GB tương đối thấp (Holmstrửm et al., 2000). Thêm vào đó, các loài thực vật chuyển gen codA, bao gồm lúa, hồng Nhật Bản (Diospyros kaki), cà chua (Salanum tuberosum, S. lycopersicum) và cải bẹ (Brassica juncea), cho thấy sự tích lũy GB tương quan với khả năng chống chịu điều kiện môi trường bị stress muối cao (Sakamoto et al., 1998; Gao et al., 2000; Prasad et al., 2000a; Park et al., 2007a; Ahmad et al., 2008).
Cây lúa chuyển gen CDH và codA phân lập từ vi khuẩn có khả năng tích lũy một lƣợng lớn chất GB trong tế bào đã đƣợc báo cáo (Takabe et al., 1998;
Sakamoto et al., 1998). Cây lúa chuyển gen cho thấy có sự tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện bị stress muối, lạnh và hạn. Sự cải thiện khả năng chịu mặn đã đƣợc quan sát thấy ở các cây lúa chuyển gen COX, hàm lƣợng GB tích lũy thậm chí thấp hơn so với hàm lƣợng GB tích lũy ở cây lúa chuyển gen CDH và codA (Su et al., 2006). Kết quả tương tự cũng được công bố ở cây lúa chuyển gen CMO biểu hiện tích lũy GB ở lục lạp (Shirasawa et al., 2006). Những kết quả này cho thấy rằng, mặc dù hàm lƣợng GB tổng hợp và tích lũy ở cây chuyển gen là khá thấp, nhưng cây lúa chuyển gen tăng cường khả năng chịu mặn. Có thể, ở cây lúa sự vận chuyển choline từ tế bào chất tới lục lạp hiệu quả hơn, nơi GB tích lũy đƣợc sử dụng hiệu quả để giảm thiểu các tác hại của muối lên bộ máy quang hợp.
Cây cà rốt (Daucus carota) chuyển gen BADH biểu hiện, tích lũy GB ở lục lạp cũng đã được chứng minh có khả năng chịu mặn. Cây cà rốt chuyển gen tăng trưởng trong điều kiện xử lý muối lên đến 400 mM NaCl, nồng độ mà tại đó các loài cây chịu mặn chỉ có thể tồn tại, trong khi các cây đối chứng không chuyển gen chậm phát triển nghiêm trọng ngay khi xử lý ở nồng độ muối 200 mM NaCl (Kumar et al., 2004). Gần đây, Waditee và đtg (2005) cũng đã chứng minh biểu hiện của gen ApGSMT và ApDMT ở tảo Synechococcus và cây Arabidopsis. Synechococcus và Arabidopsis chuyển gen cho thấy có sự tích lũy hàm lƣợng GB cao, Synechococcus phát triển mạnh dưới điều kiện độ mặn cao, lên đến 0,6 M NaCl. So với các enzyme oxi hóa choline, enzyme GSMT và SDMT tăng khả năng chịu mặn lớn ở Synechococcus. Sự biểu hiện của các enzyme oxi hóa choline cải thiện khả năng chịu mặn của Synechococcus khoảng 0,03 M NaCl, trong khi biểu hiện đồng thời 2 enzyme GSMT và SDMT cải thiện khả năng chịu mặn của Synechococcus khoảng 0,2 M NaCl, từ 0,35 lên đến 0,5 - 0,6 M NaCl. Cây Arabidopsis chuyển gen tích lũy betaine trong rễ, thân, lá, hoa và cho thấy năng suất hạt giống được cải thiện dưới điều kiện môi trường sống bị stress muối, hạn hán và nhiệt độ thấp.
1.3.2.2. Cây trồng chuyển gen tổng hợp glycine betaine tăng cường khả năng chống chịu khô hạn
Thiếu nước hoặc hạn hán là một trong những hạn chế nghiêm trọng nhất của môi trường đến sản xuất nông nghiệp. Những nghiên cứu gần đây đã tiết lộ rằng, ứng dụng GB ngoại sinh và kỹ thuật di truyền, chuyển gen tham gia sinh tổng hợp GB đều tăng cường khả năng chịu hạn của cây trồng. Quan và đtg (2004b) báo cáo, cây ngô chuyển gen CDH biểu hiện và lích lũy GB ở trong lục lạp có khả năng chịu hạn. Ngô chuyển gen cho thấy cải thiện khả năng chịu hạn ở các giai đoạn phát triển khác nhau, năng suất hạt của cây chuyển gen cao hơn đáng kể so với các cây đối chứng không chuyển gen. Cây bông chuyển gen CDH cho thấy cải thiện khả năng chịu hạn (Lv et al., 2007). Các cây bông biến đổi gen tích lũy hàm lƣợng GB lên đến 2,3 - 2,9 lần cao hơn so với các cây đối chứng không chuyển và cho thấy khả năng chịu hạn của cây chuyển gen cao hơn hẳn so với cây không chuyển gen từ giai đoạn cây con đến giai đoạn cây ra hoa. Tương tự như vậy, cây lúa chuyển gen codA cũng tăng cường tích lũy GB và cải thiện khả năng chịu hạn (Sawahel, 2003). Hơn nữa, một vài thí nghiệm cho thấy những tác động tích cực của việc ứng dụng GB ngoại sinh trên các loài thực vật bị stress về nước.
Hiệu quả tương tự cũng được tìm thấy ở cây Hướng dương và cây thuốc lá dưới điều kiện hạn hán (Iqbal et al., 2005; Ma et al., 2007). Ứng dụng GB ngoại sinh cải thiện tình trạng stress nước, kết quả sản xuất sinh khối tăng lên trong các loài thực vật này.
1.3.2.3. Cây trồng chuyển gen tổng hợp glycine betaine tăng cường khả năng chống chịu nhiệt độ thấp
Nhiệt độ thấp là một yếu tố môi trường giới hạn phân bố địa lý và mùa sinh trưởng của nhiều loài thực vật và thường ảnh hưởng xấu đến chất lượng cây trồng và năng suất (Thomashow, 1999). Các tác hại của stress nhiệt độ thấp đối với nhiều loài cây trồng là làm giảm tốc độ tăng trưởng, giảm năng suất và thậm chí làm chết cây (McKersie & Leshem, 1994). Các kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng ứng dụng GB ngoại sinh giúp bảo vệ thực vật bậc cao chống chịu tốt với điều kiện môi
trường bị stress nhiệt độ thấp (Chen et al., 2000). Ứng dụng kỹ thuật di truyển về sinh tổng hợp GB trong một số loài cây trồng đã cho thấy tăng cường tính chống chịu với điều kiện môi trường bị stress nhiệt độ thấp ở tất cả các giai đoạn khác nhau của sự phát triển của cây chuyển gen. Cây Arabidopsis chuyển gen codA, tăng cường chịu stress lạnh đã đạt được trong quá trình nảy mầm (Alia et al., 1998a).
Cây chuyển gen cho thấy tỷ lệ nảy mầm tăng cao so với cây đối chứng không chuyển gen. Kết quả tương tự cũng được báo cáo ở cây lúa chuyển gen codA và cây thuốc lỏ chuyển gen BADH (Sakamoto et al., 1998; Holmstrửm et al., 2000).
Trong cây cà chua chuyển gen codA, mặc dù hàm lƣợng GB tích lũy rất thấp nhưng cây cà chua biến đổi gen biểu hiện tăng cường khả năng chịu lạnh ở tất cả các giai đoạn phát triển, từ hạt giống nảy mầm đến giai đoạn sinh sản. Tăng cường khả năng chịu lạnh trong sự hiện diện của mức độ rất thấp GB có thể là do mức ngưỡng rất thấp GB nội sinh (0,1 mmol/g trọng lượng tươi) là đủ để cung cấp bảo vệ đầy đủ chống lại stress lạnh trong cà chua biến đổi gen (Park et al., 2004). Thêm vào đó, cây cà chua chuyển gen codA nhắm mục tiêu tích lũy GB ở trong tế bào chất và trong lục lạp, cho thấy một mối tương quan giữa tích lũy GB trong các khoang này với khả năng chịu nhiệt độ thấp, muối và oxy hóa (Park et al., 2007a).
Cây cà chua chuyển gen codA hướng mục tiêu tích lũy GB ở trong tế bào chất (cytosolic) cho thấy sự tích lũy GB tăng gấp 5 - 6 lần so với cây cà chua chuyển gen codA hướng mục tiêu tích lũy GB ở trong lục lạp. Mặc dù, sự tích lũy GB thấp ở cây chuyển gen codA hướng mục tiêu lục lạp nhưng vẫn cho thấy cây chuyển gen tăng cường khả năng chịu lạnh, muối và các căng thẳng về oxy hóa.
Stress nhiệt độ thấp gây ra rối loạn chức năng màng tế bào hoặc biến tính protein, gây ra một sự xáo trộn trong hệ thống vận chuyển điện tử vào trong màng ty lạp thể hoặc chloroplastic và dẫn đến việc sản xuất chất oxy phản ứng (ROS) (Nishiyama et al., 2001). Nồng độ ROS cao trong tế bào sẽ gây tổn hại, ảnh hưởng đến các thành phần tế bào và cũng cản trở việc sửa chữa phức hợp PSII bằng cách ức chế sinh tổng hợp de novo protein (Nishiyama et al., 2001). Park và đtg (2007a)
cho rằng một trong những lý do có thể bảo vệ tốt hơn chống lại stress nhiệt độ thấp ở cây cà chua chuyển gen codA hướng mục tiêu tích lũy GB trong lục lạp có thể là cải thiện khả năng vận chuyển oxy của phức hợp PSII do các sửa chữa đƣợc cảm ứng bởi GB. Một lý do khác, có thể là GB ổn định toàn vẹn cấu trúc của màng tế bào chống lại nhiệt độ khắc nghiệt, làm giảm peroxy lipid màng và bảo vệ PSII electron vận chuyển (Chen et al., 2000; Hamilton & Heckathorn, 2001). Tác dụng tương tự về chức năng bảo vệ của GB đã được quan sát thấy ở cây ngô chuyển gen CDH (Quan et al., 2004a).
Một khía cạnh khác có hại của stress nhiệt độ thấp là nó gây ra việc sản xuất hydrogen peroxide (H2O2), mà lần lƣợt kích hoạt sự tổng hợp của catalases (Prasad et al., 1994). Việc ứng dụng GB ngoại sinh và nội sinh làm tăng cường hoạt động catalase và do đó tăng cường khả năng chịu stress nhiệt độ thấp. Sự gia tăng hoạt động catalase đã được quan sát thấy trong các cây cà chua chuyển gen codA hướng mục tiêu tích lũy ở lục lạp, các cây cà chua chuyển gen đã đƣợc chứng minh tăng khả năng chịu lạnh và oxy hóa (Park et al., 2007a).
GB tích lũy trong lục lạp và kết quả tăng cường khả năng chịu nhiệt độ thấp là một dấu hiệu cho thấy tăng GB cấp trong các lục lạp liên quan chặt chẽ với phức hệ PSII hoạt động trong quá trình stress lạnh (Park et al., 2004). Tương tự như vậy, trong lá cà chua chuyển gen codA nhắm mục tiêu lục lạp cho thấy hầu hết GB đƣợc tích lũy trong lục lạp. Kết quả tương tự cũng được tìm thấy ở cây lúa và Arabidopsis chuyển gen codA (Sakamoto et al., 1998; Sakamoto et al., 2000).
Những phát hiện này cho thấy rằng sự tích lũy GB trong lục lạp có hiệu quả bảo vệ bộ máy quang hợp khỏi các tác hại gây ra bởi stress nhiệt độ thấp.
1.3.2.4. Cây trồng chuyển gen tổng hợp glycine betaine tăng cường khả năng chống chịu nhiệt độ cao
Các nghiên cứu trước đó cho thấy quang hợp là mục tiêu chính trong nghiên cứu về ức chế bằng nhiệt độ cao và PSII là thành phần nhạy cảm nhất với nhiệt độ trong hệ thống này (Berry & Bjửrkman, 1980). Cỏc kết quả cho thấy, khi nhiệt độ cao
hơn 45oC, PSII bị ảnh hưởng rõ rệt nhất bởi nhiệt độ (Havaux, 1996). Nhiệt độ cao vừa phải thường ức chế sự cố định CO2 và không có khả năng phá hủy PSII (Haldimann & Feller, 2004). Nhiệt độ cao thường có ảnh hưởng đến quá trình quang hợp, trong khi tiếp xúc với nhiệt độ cao vừa phải làm suy yếu hoạt tính của ribulose- 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO) qua đó làm giảm khả năng quang hợp (Haldimann & Feller, 2005). Cơ chế của các quá trình này thường có liên quan tới sự loại bỏ hoạt tính của một số vị trí hoạt động của Rubisco dẫn đến tỷ lệ quang hợp giảm và việc loại bỏ hoạt tính tăng dần theo sự tăng của nhiệt độ (Salvucci
& Brandner, 2004). Hiện tƣợng này đã đƣợc chứng minh qua các nghiên cứu trên cây bông, cây thuốc lá, Arabidopsis, và cây lúa mạch (Haldimann & Feller, 2005).
Một vài nghiên cứu in vitro cho thấy GB bảo vệ các enzyme và phức hợp protein chống lại sự bất hoạt do tác dụng của hơi nóng (Gorhan, 1995). GB có hai chức năng là sửa chữa phức hợp PSII trong quá trình ức chế quang năng và bảo vệ phức hợp protein khỏi tác dụng của hơi nóng (Allakhverdiev et al., 2007). GB ổn định phức hợp PSII bằng cách kích thích sự sửa chữa của phức hợp khi cây tiếp xúc với nhân tố gây ức chế là hơi lạnh và độ mặn (Park et al., 2004). Một cơ chế tương tự có thể xảy ra trong quá trình gây ức chế bằng nhiệt độ. Cây Arabidopsis chuyển gen codA (làm tích lũy GB) cho thấy sự kích thích khả năng chống chịu với nhiệt độ cao trong quá trình sinh trưởng của các cây con. Có thể sự chống chịu với nhiệt độ cao đƣợc cảm ứng trong cây Arabidopsis chuyển gen do sự bảo vệ enzyme hoạt hóa Rubisco được hoạt hóa bởi GB. Sự phát hiện này đươc củng cố bằng sự tăng hoạt động quang hợp ở cây thuốc lá chuyển gen BADH (Yang et al., 2005). Cơ sở sinh lý cho sự tăng khả năng chống chịu với nhiệt độ cao (25 – 45oC) của cây thuốc lá chuyển gen có liên quan tới sự tăng khả năng chống chịu của sự quang hợp với nhiệt độ cao. Nhiệt độ cao vừa phải không ảnh hưởng đến hoạt động hoặc hiệu quả của PSII và tỷ lệ đồng hóa CO2 tăng do cảm ứng với GB có liên quan tới sự hoạt hóa của Rubisco nhờ các enzyme trung gian (Yang et al., 2005). Sự tích tụ GB làm tăng sự chống chịu của các enzyme hoạt hóa Rubisco với nhiệt độ cao, dẫn đến sự tăng khả năng chống chịu của việc đồng hóa CO2 trong cây chuyển gen so với cây không chuyển gen. Trong nghiên cứu gần đây, sự tích tụ GB trong cây thuốc lá
chuyển gen BADH làm tăng sự chống chịu của PSII với nhiệt độ rất cao (lên tới 50oC) và cải thiện tính bền ở nhiệt độ cao của phức hợp vận chuyển oxy và của trung tâm phản ứng của PSII (Yang et al., 2007).
Bảng 1.2: Một số loài cây trồng chuyển gen mã hóa enzyme tham gia sinh tổng hợp glycine betaine, tăng khả năng chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi.
Loài cây Gen Sự tích lũy GB (cơ quan)
Cơ quan đích
Khả năng chống chịu bất
lợi
Tài liệu tham khảo
Arabidopsis thaliana
codA
(COD) 1.0 àmol g-1 trọng
lượng tươi(lá/hạt) Lục lạp Nhiệt độ thấp, mặn
Hayashi et al.
1997, 1998 Arabidopsis
thaliana
codA 12.0-18.0 àmol g-1 trọng lƣợng khô (hạt)
Lục lạp Nhiệt độ cao
Alia et al.
1998b Arabidopsis
thaliana
codA Nồng độ chƣa xác định (chồi)
Lục lạp Ánh sáng
mạnh Alia et al. 1999 Arabidopsis
thaliana codA 0.7-0.9 àmol g-1 trọng lƣợng khô (chồi)
Lục lạp
Băng giá Sakamoto et al.
2000 Cải bẹ codA 0.82 àmol g-1 trọng
lượng tươi (lá) Lục lạp Mặn Waditee et al.
2005 Hồng codA 0.1-0.3 àmol g-1 trọng
lượng tươi (lá)
Tế bào
chất Hạn, mặn Huang et al.
2000 Bạch đàn codA 0.17-0.29 mmol g-1
trọng lượng tươi (lá)
Chƣa xác định
(N.A)
Mặn Yu et al. 2009 Lỳa codA 5.3 àmol g-1 trọng
lượng tươi (lá)
Lục lạp/tế bào chất
Nhiệt độ thấp, mặn
Sakamoto et al. 1998 Lỳa codA 1.0-2.12 àmol g-1
trọng lƣợng khô (lá) Lục lạp Mặn Mohanty et al. 2002 Cà chua codA 0.1-0.3 àmol g-1
trọng lượng tươi (lá) Lục lạp Nhiệt độ thấp
Park et al.
2004 Cà chua codA
2.0 àmol g-1 trọng lượng tươi (cơ quan sinh sản)
Lục lạp/tế bào chất
Nhiệt độ thấp, mặn,
oxy hóa
Park et al.
2007a Cà chua codA 0.9-1.43 àmol g-1
trọng lượng tươi (lá) Lục lạp oxy hóa, mặn, hạn
Ahmad et al.
2008 Arabidopsis
thaliana
GSMT/S DMT
0.8–1.7 mmol g-1 trọng lượng tươi (hạt)
N.A.
Mặn Waditee et al.
2005 Cải dầu
COX 13 mmol g-1 trọng lƣợng khô (lá)
Tế bào
chất Hạn, mặn Huang et al.
2000 Cà rốt
BADH 93–101 mmol g-1
trọng lƣợng khô (rễ, Lục lạp Mặn Kumar et al.
2004