Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.5. Phương pháp phân tích và đánh giá cây chuyển gen
2.2.5.2. Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen
Mẫu được chuyển gen một tuần, chồi, cây ra rễ trên môi trường chọn lọc được kiểm tra sự biểu hiê ̣n G US theo phương pháp của Jefferson và đtg (1987): Mẫu đƣợc ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc ở 370C trong 24 giờ, sau đó mẫu đƣợc tẩy hết diệp lục bằng ethanol 70% và quan sát trên kính lúp soi nổi. Enzyme GUS xúc tác cho phản ứng chuyển hóa cơ chất X-Gluc tạo màu xanh đặc trƣng.
b) Phân tích hoạt động của promoter rd29A ở cây Xoan ta chuyển gen
Cây Xoan ta chuyển gen và đ ối chứng được xử lý ha ̣n nhân ta ̣o bằng 10%
PEG (Jun et al., 2001). Sau đó kiểm tra hoạt động của promoter rd29A bằng 2 cách sau: (1) Sau 48 giờ xử lý lá được cắt ra để kiểm tra s ự biểu hiê ̣n GUS (Jefferson et al., 1987). (2) Tách chiết protein tổng số từ mẫu lá Xoan ta: Nghiền 100 mg lá tươi trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ, bổ sung 0,5 ml dung dịch chiết (50 mM NaPO4 pH 7.0, 1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 10 mM β-Mercaptoethanol, 25 μg/ml PFSF), lắc đều, ly tâm tốc độ 13.000 v/p, 40C, 10 phút, sau đó hút phần dịch nổi sang ống eppendorf mới. Nồng độ protein tổng số được định lượng theo phương pháp của Bradford (1976). Hoạt tính của GUS được xác đi ̣nh thông qua phản ứng phân hủy MUG thành Mu theo phương pháp của Fior và đtg (2009).
c) Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển ở mức độ phiên mã bằng kỹ thuật RT- PCR
RNA tổng số từ mẫu lá của cây chuyển gen được tách chiết theo hướng dẫn của bộ Kit Purelink TM Plant RNA Reagent. Sau đó mRNA đƣợc tách chiết theo hướng dẫn của bộ Kit FastTrack R MAG mRNA Isolation” của hãng Invitrogen.
mRNA đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng RT-PCR nhƣ sau:
Tổng hợp cDNA từ mRNA
cDNA sợi đơn đƣợc tổng hợp từ khuôn của mRNA bằng Kít tổng hợp cDNA
“SuperScript™ III First Strand Kits” của hãng Invitrogen. Các bước tiến hành như sau:
Bước 1. Chuẩn bị: Ống 1 với thành phần như bảng 2.9:
Bảng 2.9: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ở ống 1
STT Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)
1 Primer (50àM oligo(dT)20 1
2 10mM dNTP mix 1
3 mRNA 5
4 DEPC-treated water 3
Tổng thể tích 10
Hỗn hợp dung dịch trên đƣợc trộn đều, ủ ở 650C trong 5 phút, sau đó ủ trong đá ít nhất 1 phút.
Ống 2 với thành phần nhƣ bảng 2.10:
Bảng 2.10: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ở ống 2
STT Thành phần Thể tớch (àl)
1 10X RT buffer 2
2 25mM MgCl2 4
3 0,1M DTT 2
4 RNaseOUTTM (40U/ àl) 1
5 SuperScriptTM III RT(200 U/ àl) 1
Tổng thể tích 10
Bước 2. Tiến hành:
- Lấy 10 àl dung dịch ở ống 1 cho vào ống 2 rồi trộn đều - Ủ ở 50oC trong 50 phút
- Kết thúc phản ứng ở 85oC trong 5 phút rồi ủ trong đá
- Thờm 1 àl RNase H vào ống, ủ ở 37oC trong 20 phỳt để loại bỏ sợi mRNA - Sản phẩm cDNA sợi đơn đƣợc sử dụng làm khuôn để nhân gen.
Nhân gen P5CSm từ cDNA
Phản ứng nhân gen P5CSm từ cDNA có thành phần nhƣ sau:
Bảng 2.11: Thành phần phản ứng PCR nhân gen P5CSm từ cDNA
STT Thành phần Thể tớch (àl)
1 DEPC treated water 13,5
2 Đệm PCR 10X 2,5
3 MgCl2 (25mM) 2,5
4 dNTPs (10 mM) 2,0
5 Mồi xuôi (10 pM) 1,0
6 Mồi ngƣợc (10 pM) 1,0
7 cDNA 2,0
8 Taq polymerase (5u/àl) 0,5
Tổng 25
Trình tự mồi xuôi F1: 5’-ATG GAG AAC ACA GAT CCT TGT-3’ và R1:
5’-GAA GAT CCA ATT GGT CGA GTG T-3’ cho nhân một đoạn gen P5CS có kích thước 1100 bp.
Chu kỳ nhiệt độ: 94oC/3 phút; 35 chu kì [94oC/1 phút, 56oC/50 giây, 72oC/1 phút 30 giây]; 72oC/10 phút và kết thúc phản ứng ở 4oC. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%, nhuộm bằng ethidium bromide, soi dưới đèn UV và chụp ảnh.
Nhân gen TP-codA và codA từ cDNA
Phản ứng nhân gen TP-codA và codA từ cDNA có thành phần nhƣ sau:
Bảng 2.12: Thành phần phản ứng PCR nhân gen TP-codA và codA từ cDNA
STT Thành phần Thể tớch (àl)
1 DEPC treated water 13,5
2 Đệm PCR 10X 2,5
3 MgCl2 (25mM) 2,5
4 dNTPs (10 mM) 2,0
5 Mồi xuôi (10 pM) 1,0
6 Mồi ngƣợc (10 pM) 1,0
7 cDNA 2,0
8 Taq polymerase (5u/àl) 0,5
Tổng 25
Trình tự mồi xuôi F2: 5'-GAC TAC ATT GTT GTT GGA GGT G-3' và mồi ngƣợc R2: 5'-GTA GAA AGT ACG ACT TCG TTT CTA G-3' cho nhân một đoạn gen codA có kích thước 760 bp.
Phản ứng nhân gen TP-codA từ cDNA có chu kỳ nhiệt độ: 94oC/3 phút; 30 chu kì [94oC/1 phút, 56oC/50 giây, 72oC/1 phút]; 72oC/10 phút và kết thúc phản ứng ở 4oC. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%, nhuộm bằng ethidium bromide, soi dưới đèn UV và chụp ảnh.