Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2. TẠO CÂY XOAN TA CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RD29A::GUS
Promoter rd29A trong hệ gen của cây Arabidopsis thaliana đƣợc xác định liên quan đến sự điều hòa hoạt động của các gen trong điệu kiện khô hạn, có tiềm năng ứng dụng lớn trong việc phát triển, cải thiện chất lƣợng của cây trồng. Một số nghiên cứu đã phát hiện đƣợc trình tự promoter rd29A chứa 2 vùng có hoạt tính cis là vùng cảm ứng ABA (ABRE) và vùng cảm ứng mất nước (DRE)/C repeat (CRT).
Cả 2 vùng đều liên quan đến sự điều hòa hoạt động của các gen trong điệu kiện bất lợi của môi trường. Hoạt động đặc hiệu của promoter rd29A cảm ứng hạn đã được nghiên cứu chứng minh ở nhiều loài cây trồng (cây thân thảo) nhƣ: lúa mì, khoai tây, mía, thuốc lá. Với mục tiêu ứng dụng promoter rd29A trong nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn ở cây thân gỗ (cây lâm nghiệp), chúng tôi tiến hành phân tích hoạt động của promoter rd29A ở cây Xoan ta chuyển gen.
3.2.1. Tạo dòng cây Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc rd29A-gus
Với tổng số 85 mẫu (đoạn thân mầm Xoan ta) cho xâm nhiễm với chủng vi khuẩn A. tumefaciens CV58C1 mang vector chuyển gen pBI121::rd29A-gus (Nguyễn Thị Thúy Hường et al., 2010) và nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi chọn lọc SM (MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin + 150 mg/l kanamycin + 300 mg/l cefotaxime + 30 g/l sucrose + 8,0 g/l agar ), sau 25 ngày thu đƣợc 20 chồi tái sinh. Cấy chuyển 20 chồi tái sinh sang môi trường ra rễ chọn lọc R (MS + 0,3 mg/l IBA + 50 mg/l kanamycin + 20 g/l sucrose + 8,0 g/l agar) thu đƣợc 12 chồi ra rễ (bảng 3.8). Kết quả phân tích cây chuyển gen bằng PCR nhân đoạn promoter rd29A kích thước 1,29 kb cho thấy cả 12 cây Xoan ta ra rễ trên môi trường chọn lọc 50
mg/l kanamycin đều dương tích (hình 3.5). Kết quả này cho thấy đã chuyển thành công cấu trúc gen promoter rd29A-gus vào cây Xoan ta, các cây Xoan ta chuyển gen đƣợc sử dụng để phân tích hoạt động của promoter rd29A cảm ứng hạn.
Bảng 3.8: Kết quả thí nghiệm chuyển cấu trúc rd29A-gus vào Xoan ta Lô thí
nghiệm
Số mẫu biến nạp
Số chồi tái sinh/
môi trường SSM
Số chồi ra rễ/môi trường R
Số cây dương tính với PCR
1 30 7 5 5
2 27 5 3 3
3 28 8 4 4
Tổng số 85 20 12 12
Hình 3.5: PCR nhân promoter rd29A từ các cây Xoan ta chuyển gen.
M: thang DNA 1 kb; - : mẫu đối chứng âm (cây không chuyển gen); +: mẫu đối chứng dương (plasmid pBI121::rd29A-gus); C1 – C12: các cây Xoan ta chuyển gen.
3.2.2. Đánh giá hoạt động của promoter rd29A ở cây Xoan ta chuyển gen 3.2.2.1. Đánh giá hoạt động của promoter rd29A thông qua phản ứng nhuộm X-Gluc
Để xác định hoạt động của rd29A trên các cây Xoan ta dương tính với phản ứng PCR, chúng tôi chọn ngẫu nhiên 5 cây để tiến hành xử lý bởi hạn nhân tạo bằng 10%
PEG (polyethylene glycol) trong 48 giờ. Các mẫu lá được lấy trước và sau gây hạn để nhuộm X-Gluc và kiểm tra. Kết quả cho thấy dưới điều kiện thiếu nước biểu hiện của GUS ở mẫu lá của cây Xoan ta chuyển gen khá mạnh và rõ ràng, còn các mẫu lá của cây Xoan ta chuyển gen trước xử lý hạn và đối chứng (không chuyển gen) không thấy sự biểu hiện của GUS (hình 3.6). Từ kết quả thu đƣợc cho thấy ở cây Xoan ta promoter rd29A hoạt động đặc hiệu khi điều kiện môi trường bị hạn.
M – + C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12
1.29 kb 1.5 kb
1.0 kb
Hình 3.6: Biểu hiện GUS ở lá cây Xoan ta chuyển gen rd29A-gus
a) Cây đối chứng không chuyển gen có xử lý hạn; b) Lá cây chuyển gen trước xử lý
hạn; c) Lá cây chuyển gen sau xử lý hạn 48 giờ.
3.2.2.2. Đánh giá hoạt động của promoter rd29A thông qua xác định hoạt tính enzyme β- glucuronidase
Bên cạnh việc đánh giá hoạt động của promoter rd29A bằng phương pháp phát hiện khả năng biểu hiện GUS ở trên lá của các dòng cây chuyển gen khi bị xử lý bởi hạn nhân tạo, hoạt tính của enzyme GUS còn đƣợc xác định thông qua phản ứng chuyển hóa cơ chất 4-methylumbelliferyl--D-glucuronide (MUG). Enzyme GUS xúc tác cho phản ứng chuyển hóa MUG thành 4-methylumbelliferone (MU), hoạt tính của enzyme GUS càng mạnh thì lƣợng MU đƣợc tạo ra càng nhiều. MU được phát hiện bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sóng 378 nm (Fior et al., 2009).
Hình 3.7: Hoạt tính của enzyme GUS ở các cây Xoan ta chuyển gen.
WT: cây không chuyển gen; C1, C2, C5, C7, C10: các cây chuyển gen, K: trước xử lý hạn, XL: sau xử lý hạn.
a a b c
Dựa trên lƣợng MU sinh ra trong một đơn vị thời gian và trong một mg protein tổng số, hoạt tính của enzyme GUS đƣợc đánh giá ở cây đối chứng và các cây chuyển gen trong điều kiện trước và sau gây hạn nhân tạo (hình 3.7). Từ kết quả thu đƣợc cũng cho thấy rõ sự khác biệt về hoạt tính của enzyme GUS trên các cây Xoan ta chuyển gen trước và sau xử lý bởi hạn nhân tạo. Ở cây đối chứng lượng MU đo được ở cả mẫu trước và sau gây hạn gần như không đáng kể. Ngược lại, ở các cây Xoan ta chuyển gen lượng MU đo được trên các mẫu trước và sau xử lý bởi hạn nhân tạo có sự khác biệt rất rõ ràng, hoạt tính enzyme GUS của các mẫu Xoan ta chuyển gen sau xử lý hạn tăng gấp 5-8 lần so với các mẫu trước xử lý hạn. Từ các kết quả thu đƣợc có thể thấy rõ sự hoạt động của promoter rd29A trên cây Xoan ta là rất đặc hiệu với điều kiện khô hạn.