Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.5. Phương pháp phân tích và đánh giá cây chuyển gen
2.2.5.3. Đánh giá sinh lý của các dòng cây chuyển gen
a) Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng Xoan ta chuyển gen P5CSm
Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các dòng Xoan ta chuyển gen đƣợc tiến hành ở giai đoạn cây con (1 tháng tuổi). Các dòng Xoan ta chuyển gen và đối chứng không chuyển gen được xử lý khô hạn (không tưới nước trong 10 ngày), nuôi trong buồng sinh trưởng với điều khiện nhiệt độ 27 ± 2oC, độ ẩm 60%, cường độ chiếu sáng 4.000 – 5.000 lux, thời gian chiếu sáng 14h/ngày. Khả năng chịu hạn của các dòng cây Xoan ta chuyển gen đƣợc đánh giá thông qua hình thái và hàm lƣợng proline tích lũy.
b) Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng thuốc lá chuyển gen TP-codA và codA
i) Sàng lọc khả năng chịu mặn của dòng thuốc lá chuyển gen in vitro:
- Chồi của các dòng thuốc lá chuyển gen TP-codA, codA và đối chứng không chuyển gen được nuôi cấy trên môi trường ra rễ (MS + 0,1mg/l NAA + 30g/l sucrose + 8g/l agar + 250mg/l cefotaxime) bổ sung 200mM NaCl.
- Mảnh lá của các dòng thuốc lá chuyển gen TP-codA và đối chứng không chuyển gen được nuôi cấy trên môi trường tái sinh (MS + 1mg/l BAP + 30g/l sucrose + 8g/l agar + 250mg/l cefotaxime) bổ sung 200mM NaCl.
ii) Đánh giá khả năng chịu mặn của dòng thuốc lá chuyển gen ở nhà lưới
Chọn dòng thuốc lá chuyển gen có triển vọng chịu mặn tốt nhất (thu đƣợc ở mục 2.2.5.3b,i) nhân nhanh chồi, cho ra rễ và đƣa ra trồng trong chậu đất (giá thể NT1 của Viện Nông hóa thổ nhƣỡng). Sau 10 ngày trồng trên giá thể, cây thích nghi, sinh trưởng và phát triển bình thường, bắt đầu xử lý mặn ở các nồng độ nước muối khác nhau 100 mM, 200 mM và 300 mM NaCl. Cách xử lý mặn: 1 kg đất trồng/chậu được tưới 1 lít nước muối với nồng độ như trên, tưới tràn chậu (các chậu cây xử lý mặn ở mỗi công thức đƣợc đặt trong một khay nhựa nhƣ hình 2.4). Các lần tưới sau bằng nước máy nhưng tưới nhỏ giọt đảm bảo nước không bị chảy ra ngoài nhằm tránh hiện tƣợng rửa trôi muối. Khả năng chịu mặn của các dòng thuốc lá được đánh giá qua hình thái, sinh trưởng, hàm lượng diệp lục và hàm lượng glycine betaine tích lũy trong lá.
Hình 2.4: Mô hình các dòng thuốc lá trồng trong chậu đất, đặt trong khay nhựa để xử lý mặn.
c) Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng Xoan ta chuyển gen TP- codA/codA
i) Sàng lọc sơ bộ khả năng chịu mặn của dòng Xoan ta chuyển gen in vitro:
Chồi của các dòng Xoan ta chuyển gen TP-codA/codA đƣợc nuôi cấy trên môi trường tái sinh (MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin + 30g/l sucrose + 7.5 g/l agar) bổ sung NaCl ở các nồng độ (100 mM, 150 mM và 200 mM). Nuôi dưới ánh sáng dàn đèn phòng nuôi cây. Đánh giá khả năng chịu mặn thông tỉ lệ mẫu sống, sinh trưởng.
ii) Đánh giá khả năng chịu mặn của dòng Xoan ta chuyển gen TP-codA/codA Chọn dòng Xoan ta chuyển gen có triển vọng chịu mặn tốt nhất (thu đƣợc ở mục 2.2.5.3.c i) nhân nhanh chồi, cho ra rễ và đƣa ra trồng trong chậu đất (giá thể NT1). Sau 1 tháng trồng trên giá thể, cây thích nghi, sinh trưởng và phát triển bình thường, bắt đầu xử lý mặn ở các nồng độ nước muối khác nhau 300, 400 và 500 mM NaCl. Cách xử lý mặn: 1 kg đất trồng/chậu được tưới 1 lít nước muối với nồng độ như trên, tưới tràn chậu (các chậu cây xử lý mặn ở mỗi công thức được đặt trong một khay nhựa như hình 2.5). Các lần tưới sau bằng nước máy nhưng tưới nhỏ giọt đảm bảo nước không bị chảy ra ngoài nhằm tránh hiện tượng rửa trôi muối. Khả năng chịu mặn của các dòng Xoan ta được đánh giá qua hình thái, sinh trưởng, hàm lƣợng diệp lục và hạm lƣợng glycine betaine tích lũy trong lá.
Hình 2.5: Mô hình các dòng Xoan ta trồng trong chậu đất, đặt trong khay nhựa để xử lý mặn.
iii) Đánh giá khả năng chịu hạn của dòng Xoan ta chuyển gen TP-codA/codA Phương pháp trình bày như mục 2.2.5.3a. Khả năng chịu hạn của các dòng Xoan ta đƣợc đánh giá qua hình thái và hàm lƣợng glycine betaine tích lũy trong lá.
2.2.5.4. Xác định hàm lƣợng diệp lục
Hàm lượng diệp lục trong lá được xác định theo phương pháp của Lichtenthaler & Wellburn (1983).
2.2.5.5. Xác định hàm lƣợng proline
Hàm lượng proline trong lá được xác đinh theo phương pháp của Bate và đtg (1973).
2.2.5.6. Xác định hàm lương glycine betaine
Hàm lượng glycine betaine được xác định theo phương pháp của Grieve và Grattan (1983).