Chương 2: ĐỐI TƯỢNG - ĐỊA ĐIỂM - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu bệnh khô cành ngọn Keo tai tượng
- Phương pháp mô tả triệu chứng và đặc điểm bào tử + Triệu chứng bệnh
Chọn các cây có triệu chứng bệnh, thể hiện về mặt hình thái rõ nhất và đại diện nhất. Quan sát triệu chứng bằng mắt thường hoặc kính lúp các đặc điểm bên ngoài của thân, cành, lá bị bệnh như biến đổi về màu sắc chỗ thân cành bị bệnh, bệnh trạng, sự phân bố bệnh trên thân, cành, lá. Mô tả và chụp ảnh thân, cành, lá bị bệnh.
+ Đặc điểm bào tử
Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái bào tử được quan sát trên kính hiển vi Olympus BX50 độ phóng đại 2000 lần về hình dáng, kích thước, màu sắc, thể bám.
- Phương pháp phân lập nấm gây bệnh và đặc điểm của hệ sợi nấm + Phân lập nấm gây bệnh
Phân lập trực tiếp trên môi trường PDA: Lấy mẫu bệnh của cây Keo tai tượng, tiến hành rửa sạch bằng nước cất vô trùng, sau đó khử trùng bề mặt bằng cồn 700 rồi rửa lại 2 - 3 lần bằng nước cất vô trùng. Sau khi đã khử trùng mẫu bệnh xong thì cắt thành từng mẩu nhỏ 1 - 2 mm rồi cấy trên môi trường PDA được đựng trong hộp lồng. Đặt các hộp lồng đã cấy mẫu bệnh này trong tủ định ôn ở nhiệt độ 280C trong khoảng 2 - 3 ngày để cho sợi nấm phát triển mọc trên môi trường. Khi nấm đã mọc ta tiến hành cấy chuyển nấm sang các hộp lồng khác để thuần khiết nấm bệnh.
Nuôi cấy đơn bào tử: Lấy mẫu bệnh cắt thành các đoạn nhỏ khoảng 5 - 7 cm cho vào hộp lồng ẩm (dùng hộp lồng đã được khử trùng, sau đó để giấy ẩm vào trong) hộp lồng cần có độ ẩm thích hợp không được ẩm quá cũng như khô quá để tạo môi trường thích hợp cho sự phát triển của nấm bệnh, tiếp theo dùng băng keo
quấn 2 đến 3 vòng, để hộp lồng từ 2 - 3 ngày thấy trên mẫu bệnh xuất hiện khối bào tử thể quả nấm. Dùng que cấy chạm nhẹ vào khối bào tử và cấy trên môi trường PDA. Đặt hộp lồng vào tủ định ôn ở nhiệt độ 280C và theo dõi sự phát triển của nấm bệnh. Khi sợi nấm bắt đầu mọc, cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới.
+ Phương pháp nghiên cứu đặc điểm của hệ sợi nấm
Đặc điểm của hệ sợi được quan sát trên kính hiển vi Olympus BX50 độ phóng đại 1000 lần về hình dáng, kích thước, màu sắc, độ dầy của sợi nấm, hệ sợi, vách ngăn của hệ sợi.
- Phương pháp giám định nấm gây bệnh + Giám định theo khóa định loại
Giám định nấm gây bệnh theo khóa định loại là phương pháp dựa trên nhữmg triệu chứng bệnh đã mô tả, đặc điểm hình thái bào tử quan sát trên kính hiển vi, hình dáng, kích thước, màu sắc, độ dầy của sợi nấm, hệ sợi là những căn cứ trong khóa phân loại nấm. Giám định nấm bệnh dựa trên khoá định loại và mô tả đến loài để xác định loài nấm gây bệnh (Sharma J.K. and Florence. E.J.M;
1997)[101].
+ Phương pháp giám định bằng sinh học phân tử
Tách ADN: Tách ADN của nấm sử dụng phương pháp glassmilk, cho một lượng nhỏ sợi nấm vào ống eppendorf 1.5 ml. Tán nhỏ các vật liệu trên trong ống eppendorf bằng chày kết hợp với nitơ lỏng. Thờm vào đú khoảng 300-500 àl chất tách chiết ADN (Reader & Broda 1985)[94]. Ống eppendorf được ủ trong bể nước ở nhiệt độ 650C trong 60 phút. Sau đó được ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 15 phỳt. Khoảng 200 àl dịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới trong cú chứa 800 àl NaI 100% (trạng thỏi lạnh) và 7 àl glassmilk. Hỗn hợp được làm lạnh và lắc đều trong vòng 15 phút để ADN gắn vào glassmilk, sau đó được ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 10 giây. Phần kết tủa được rửa sạch bằng dung dịch đệm và cồn. Sau đó hỗn hợp được ly tâm, tách phần kết tủa và làm khô. Phần kết tủa được hũa tan trong 25 àl dung dịch TE (10 mM Tris HCl pH8, 1 mM EDTA), hỗn hợp được ủ trong bể nước ở 450C trong vòng 5 phút. Ống eppendorf được ly
tâm ở 14000 vòng/phút trong 2 phút, phần hỗn hợp chứa ADN được chuyển sang ống eppendorf mới, bảo quản ở 40C (Trần Thanh Trăng, 2008)[37].
Phản ứng PCR: Vùng ITS 1 và 2 được phản ứng từ ADN vừa thu trên bằng cặp mồi đặc hiệu cho vùng gen ITS1-F của nấm (Gardes và Bruns 1993)[57] và ITS4 (White et al. 1990)[110]. Trong 50 àl phản ứng PCR, 10 àl ADN được sử dụng như bản mẫu. Mỗi phản ứng PCR gồm có 1x polymerase chất đệm (Fisher Biotec), 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0.25 àM cho mỗi loại mồi, và 0.08 U TTH+ polymerase (Fisher Biotec) và 0.2 mg/ml chất BSA (Bovine Serum Albumin, Fisher Biotec). Thông số phản ứng PCR như sau: bước khởi đầu tách đôi sợi ADN ở 950C trong 3 phút. Sau đó là 35 chu kỳ: tách sợi ADN ở 940C trong 30 giây, giai đoạn nhân bản ở nhiệt độ 550C trong 30 giây, ở chu kỳ cuối cùng sự kéo dài được thực hiện ở 720C trong 7 phút. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR loại PTC 225 Peltier Thermal Cycler.
Điện ly: Các sản phẩm PCR được điện ly trên bản gel (2,5% agarose) ở 4 volts/cm, trong 30 phút. Thang ADN 100bp (Fisher Biotec) được sử dụng để ước lượng kớch cỡ ADN. Bản gel được nhuộm trong ethidium bromide (1àg/1ml), lắc ở tốc độ chậm trong 15 phút. ADN được quan sát dưới tia cực tím và được chụp ảnh với máy ảnh Kodak EDAS290.
Tách dòng nấm từ sản phẩm PCR: Sau khi được phản ứng (PCR), các sản phẩm PCR từ các mẫu bệnh có nhiều dải ADN trên bản gel được tách dòng bằng bộ kít tách dòng, sử dụng véc-tơ pGEMR-T (Promega). Quá trình gắn ADN vào véc-tơ pGEMR-T được tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sản phẩm (các dòng) sau đó được phân tích biến động chuỗi bằng phương pháp PCR – RFLP. Các enzym giới hạn Hinf I và Tag I được sử dụng riêng rẽ để cắt các dòng. Sản phẩm cắt được điện ly trên bản gel 25 cm với 2.5% Hi-Resolution agarose (Progen Industries Limited) ở 100 volts trong 5 giờ. Các dòng của mỗi mẫu gỗ được phân nhóm dựa trên hình thái PCR-RFLP và đại diện của mỗi nhóm được phản ứng PCR (như trên) và xác định trình tự chuỗi (Trần Thanh Trăng, 2008)[37].
Xỏc định trỡnh tự chuỗi phõn tử ADN: 90-100 àl sản phẩm PCR được làm sạch bằng bộ kít MO BIO Laboratories, Inc. UltraCleanTM PCR Lean-up. Phản ứng xác định trình tự chuỗi: Sử dụng bộ kít Quick Start với một số thay đổi như sau:
Mỗi phản ứng xỏc định trỡnh tự chuỗi ADN gồm 10 àl, trong đú sử dụng 3-5 àl ADN mẫu cựng với 3.2 pmol mồi (ITS1-F) và 2 àl DTCS Quick Start Master Mix.
Kết tủa bằng cồn: 0.25 àl của 20 mg/ml glycogen, 2 àl của 3 M Sodium Acetate và 2 àl của 100 mM Na2-EDTA được bổ xung vào mỗi phản ứng. Trỡnh tự chuỗi ADN được xác định trên hệ thống phân tích gen và được sửa trên phần mềm Chromas Lite, phiên bản 2.0, 2004. Các chuỗi ADN được sắp xếp trên ClustalW (Thompson et al. 1994)[105]. Sau đó các chuỗi ADN này được so sánh sự giống nhau với các dữ liệu trên ngân hàng gen, sử dụng phần mềm BLAST trên BioManager (ANGIS, 2005)[39] và với các dữ liệu cá nhân, sử dụng phần mềm FASTA, phiên bản 3.4 (Pearson và Lipman 1998)[91]. Ngoài ra phân tích sự tiến hóa cũng được thực hiện. Các chuỗi ADN mẫu và ADN tham khảo được sắp xếp với nhau, biểu đồ Dendrogram được tạo trên phần mềm ClustalW và ADN ml trên phần mềm Phylip (ANGIS 2005)[39]; (Felsenstein, 1998)[55] sau đó được xem trên phần mềm TreeView, phiên bản 1.6.6.
- Phương pháp đánh giá tính gây bệnh của các chủng nấm + Trong phòng thí nghiệm
Đánh giá tính gây bệnh của các chủng nấm phân lập được thông qua gây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm trên lá và cành tách rời trong điều kiện ẩm.
Thí nghiệm được tiến hành trên lá và cành non Keo tai tượng với 4 công thức, mỗi công thức 10 đĩa Petri đường kính của đĩa 10cm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Công thức 1 (CT1): Nhúng 20 lá Keo tai tượng non không bị bệnh vào cốc nước có chứa bào tử nấm bệnh với mật độ 1x106 CFU/ml sau đó để lá vào trong 10 đĩa Petri đường kính của đĩa10cm, mỗi đĩa 2 lá; giữ ẩm và băng keo lại xung quanh hộp.
Công thức 2 (CT2): Đối chứng làm tương tự CT1 nhưng thay bằng nước cất Công thức 3 (CT3): Nhúng 20 cành Keo tai tượng non không bị bệnh chiều dài 6cm, đường kính 0,5-0,7mm vào cốc nước có chứa bào tử nấm bệnh với mật độ
1x106 CFU/ml sau đó để vào trong 10 đĩa Petri giữ ẩm và băng keo lại xung quanh hộp.
Công thức 4 (CT4): Đối chứng làm tương tự CT3 nhưng thay bằng nước cất Sau 7 ngày tiến hành phân cấp bị bệnh và tính tỷ lệ bị bệnh và cấp bị bệnh bình quân cho các công thức thí nghiệm.
+ Ngoài vườn ươm
Gây bệnh nhân tạo là phương pháp kiểm tra lại để khẳng định loài nấm phân lập từ các tổ chức bị bệnh trên thân, cành, lá có phải là tác nhân chính gây nên bệnh ở ngoài hiện trường hay không. Lấy bào tử từ cơ quan sinh sản của nấm bằng que cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, cho bào tử nấm vào cốc nước vô trùng với mật độ 1x106 CFU/ml. Thí nghiệm được tiến hành với 2 công thức mỗi công thức 100 cây 3 lần lặp.
Công thức 1(CT1): Phun 500ml dung dịch có chứa bào tử nấm trên vào 100 cây Keo tai tượng 2 tháng tuổi tại vườn ươm của Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam (phường Đức Thắng, quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội) thí nghiệm được đặt ở nơi dâm mát phù hợp cho cả nấm và cây phát triển. Sau 30 ngày đánh giá mức độ bị bệnh và tỷ lệ bị bệnh của cây.
Công thức 2 (CT2): Đối chứng làm tương tự CT1 nhưng thay bằng nước cất.
Cả 2 công thức đều kiểm tra bào tử nấm trên các bộ phận của cây đã gây bệnh nhân tạo, tính tỷ lệ bị bệnh và cấp bị bệnh.
Tỷ lệ bị bệnh được tính theo công thức như sau:
P = x100
N
n
Trong đó: P là tỷ lệ cây bị bệnh; n là số cây bị bệnh; N là tổng số cây thí nghiệm.
Cấp bệnh bình quân được tính theo phương pháp bình quân:
R= N
vi ni
i 4
1
.
R là cấp bệnh bình quân
ni là số cây bị bệ ớ ệnh i vi là chỉ số của cấp bệnh i
N là tổng số cây thí nghiệm.
Mức độ bị bệnh dựa trên cấp bệnh bình quân: R = 0 cây khỏe (không bị bệnh), 0 < R < 1 cây bị bệnh nhẹ; 1< R < 2, cây bị bệnh trung bình; 2 < R < 3, cây bị bệnh nặng; 3 < R ≤ 4, cây bị bệnh rất nặng (Old et al., 2000)[86]; (Phạm Quang Thu, 2011)[32].
2.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm gây bệnh
- Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của hệ sợi nấm
Cấy nấm gây bệnh vào chính giữa hộp lồng có chứa môi trường PDA xếp các hộp lồng này vào tủ định ôn có thang nhiệt độ khác nhau 150C± 1; 200C±1;
250C ± 1; 300C ±1; 350C ±1, mỗi thang nhiệt độ 10 hộp theo dõi trong 8 ngày cứ 48 giờ đo đường kính một lần (đo hai chiều vuông góc rồi lấy trị số trung bình).
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy trị số đường kính bình quân làm đại diện cho thí nghiệm.
- Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của ẩm độ không khí đến sinh trưởng của sợi nấm
Bên cạnh nhiệt độ, ẩm độ không khí cũng là một yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của nấm. Phương pháp được tiến hành theo Both.C pha NaCl với các nồng độ khác nhau trong bình hút ẩm để tạo ra môi trường không khí có độ ẩm không khí (RH%) khác nhau cụ thể như sau:
Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6
NaCl(g/1lit) 0 8 16 24 32 40
RH % 100 95 90 85 80 75
Dung dịch pha xong đổ vào bình hút ẩm loại lớn mỗi bình 2 lít nước, đậy nắp để trong tối có nhiệt độ 280C, 48 giờ đo đường kính một lần (đo hai chiều vuông góc rồi lấy trị số trung bình). Thí nghiệm theo dõi và thu số liệu trong vòng 8 ngày. Cấy nấm vào chính giữa hộp lồng có chứa môi trường PDA, mỗi bình hút ẩm
đặt 10 hộp lồng sau 2 ngày đo đường kính nấm theo hai chiều vuông góc và lấy trị số bình quân. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy trị số đường kính nấm trung bình làm đại diện cho thí nghiệm.
- Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của hệ sợi nấm Điều chỉnh pH của môi trường nuôi cấy PDA bằng axít HCl 10% và KOH 10% để tạo môi trường dinh dưỡng có trị số pH khác nhau 4; 5; 6; 7; 8; 9.
Sau khi đã điều chỉnh pH trong các bình tam giác, môi trường được hấp khử trùng ở 1210C tương đương 1 atm trong 30 phút. Đổ môi trường có các mức pH khác nhau vào các hộp lồng đã được khử trùng dày 2-3mm. Sau khi mặt thạch khô, đông cứng tiến hành cấy nấm vào chính giữa hộp lồng băng kín hộp lồng để vào tủ định ôn 280C. Đo đường kính khuẩn lạc theo hai chiều vuông góc rồi lấy trị số trung bình ở các ngày thí nghiệm. Mỗi thang pH 10 hộp lồng, thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy trị số đường kính bình quân theo 2 chiều vuông góc làm đại diện cho thí nghiệm.
2.3.1.3. Phương pháp điều tra bệnh khô cành ngọn Keo tai tượng
Lập 30 ô tiêu chuẩn mỗi ô 500m2 theo 2 cấp tuổi (trên 3 tuổi, dưới 3 tuổi) đối với rừng trồng tại4 khu vực: Công ty Lâm nghiệp Tam Thắng, huyện Thanh Sơn tỉnh Phú Thọ, Công ty Lâm nghiệp Hàm Yên, huyện Hàm Yên tỉnh Tuyên Quang;
huyện Văn Bàn tỉnh Lào Cai, xã Gia Phú huyện Bảo Thắng tỉnh Lào Cai. Điều tra bệnh khô cành ngọn Keo tai tượng theo 4 hướng Đông, Tây, Nam, Bắc và theo 4 mùa trong năm. Tiến hành phân cấp bị bệnh cho các cây trong ô tiêu chuẩn theo 5 cấp (0-4); cấp 0 cây khỏe (không bị bệnh), cấp 1 cây bị bệnh nhẹ, cấp 2 cây bị hại trung bình, cấp 3 cây bị hại nặng, cấp 4 cây bị bệnh rất nặng với các tiêu chí của mỗi cấp bị bệnh như sau:
Số TT Cấp bệnh Biểu hiện bên ngoài
1 0 Cây khoẻ, tán lá phát triển bình thường
2 1 < 25% số lá bị bệnh hoặc < 10% cành bị bệnh 3 2 25-<50% số lá bị bệnh hoặc 10-<25% cành bị bệnh 4 3 50-<75% số lá bị bệnh hoặc 25-<50% cành bị bệnh 5 4 Trên 75% số lá bị bệnh hoặc >50% cành bị bệnh
Tỷ lệ bị bệnh được tính theo công thức như sau:
Potc = x100
N
n
Trong đó: Potc là tỷ lệ cây bị bệnh trung bình trên ô tiêu chuẩn n là số cây bị bệnh trong ô tiêu chuẩn;
N là tổng số cây điều tra trong ô tiêu chuẩn.
Pkv = N Potci
n
i 1
Trong đó: Pkv là tỷ lệ cây bị bệnh trung bình cho khu vực điều tra Potci là tỷ lệ bị bệnh bình quân trong ô tiêu chuẩn thứ i N là tổng số ô tiêu chuẩn.
Cấp bệnh bình quân của một ô tiêu chuẩn được tính theo phương pháp bình quân gia quyền, sau đó tính bình quân cho toàn bộ khu vực điều tra với các công thức sau :
Rotc = N
vi ni
i 4
1
.
Trong đó: Rotc cấp bệ ẩn
ni là số cây bệ ớ ệnh i vi là chỉ số của cấp bệnh i
N là tổng số cây điều tra
Rkv = N Rotci
n
i 1
Trong đó: Rkv cấp bệ ủa khu vực điều tra Rotci là cấp bệnh bình quân ở ô tiêu chuẩn thứ i N là tổng số ô tiêu chuẩn điều tra.
Mức độ bị bệnh dựa trên cấp bệnh bình quân: R = 0 cây khỏe (không bị bệnh); 0 < R < 1, cây bị bệnh nhẹ; 1 < R < 2, cây bị bệnh trung bình; 2 < R < 3, cây
bị bệnh nặng; 3 < R ≤ 4, cây bị bệnh rất nặng (Old et al., 2000)[86]; (Phạm Quang Thu, 2011)[32].