Chương 2: ĐỐI TƯỢNG - ĐỊA ĐIỂM - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi khuẩn nội sinh
- Phương pháp xác định môi trường nhân sinh khối tối ưu
Môi trường nhân sinh khối tối ưu: Được thử nghiệm trên 3 loại môi trường thông dụng không agar là môi trường PDA, môi trường NB và môi trường King’B.
Môi trường PDA không agar thành phần gồm:
Khoai tây : 200 gam
D- Glucose : 20 gam
Nước : 1000 ml
Khoai tây rửa sạch để cả vỏ, cắt thành khối có kích thước 1x1x1cm, cho vào đun cùng 1000 ml nước, đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nước trong, cho thêm nước để đủ 1000 ml. Sau đó cho D-glucose vào khuấy cho tan đều, cho vào 10 bình tam loại 250 ml nút bông và quấn giấy ở miệng bình, hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút (thí nghiệm được lặp lại 3 lần).
Môi trường King’B không agar
K2HPO4 : 0,15 gam
MgSO4.7H2O : 0,15 gam
Peptone : 20 gam
Glycerol : 10 ml
H2O : 1000 ml
Sau khi hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút sau đó để các bình môi trường vào trong tủ cấy, khử trùng các dụng cụ cần thiết và tiến hành trước ngọn lửa đèn cồn.
Môi trường NB không agar
Môi trường - thịt - pepton có thành phần: Nước thịt 1000ml, pepton 10g, pH=7; khử trùng 1 atm/30 phút.
Lấy từng loại chủng có hiệu lực cao, dùng que cấy khử trùng lấy từng loại VK nội sinh cho vào mỗi bình môi trường. Với mỗi loại lấy 1 vòng que cấy để đảm bảo lượng VK nội sinh đưa vào môi trường không quá ít. Nút bông và ghi rõ ký hiệu của từng loại. Cho các bình vào máy lắc, lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở 280C với thời gian lắc 72 giờ. Lấy các bình đã lắc mỗi loại ra một ít làm mẫu, đếm số bào tử hữu hiệu bằng phương pháp pha loãng tới hạn (Nguyễn Lân Dũng, 1982)[15].
- Phương pháp xác định tốc độ lắc tối ưu: Được thực hiện với 5 công thức ở các tốc độ lắc khác nhau (0, 100, 150, 200, 250 vòng/phút) mỗi tốc độ lắc 10 bình tam giác 250 ml thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cho một lượng VK nội sinh như nhau (1 vòng que cấy) vào các bình lắc ở các tốc độ khác nhau, nhiệt độ ở 280C, thời gian lắc 72 giờ.
- Phương pháp xác định thời gian nhân sinh khối tối ưu: Được thực hiện với 5 công thức ở các thời gian nuôi cấy khác nhau (24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ) mỗi công thức 10 bình tam giác 250 ml, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cho một lượng VK nội sinh như nhau (1 vòng que cấy/bình 250 ml) sau lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 280C.
Đếm số lượng khuẩn lạc ở các công thức khác nhau bằng phương pháp pha loãng tới hạn (Nguyễn Lân Dũng và Phạm Văn Ty, 1998)[6].
- Phương pháp xác định nhiệt độ nhân sinh khối tối ưu: Được tiến hành với 6 công thức ở các thang nhiệt độ khác nhau (150C, 200C, 250C, 300C, 350C, 400C) mỗi thí nghiệm 10 bình tam giác 250 ml, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cho một lượng VK nội sinh như nhau (1 vòng que cấy/bình 250 ml) vào các bình lắc với tốc độ 150 vòng/phút với thời gian lắc 72 giờ. Lấy các bình đã lắc mỗi loại ra một ít làm mẫu, đếm số khuẩn lạc bằng phương pháp pha loãng tới hạn.
2.3.3.2. Tạo chế phẩm và đánh giá chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản Phương pháp tạo chế phẩm
Các bước tạo chế phẩm VK nội sinh bao gồm:
- Chuẩn bị nguyên liệu
- Chọn các chủng VK nội sinh có hoạt tính cao (không sinh độc tố, khả năng sinh tổng hợp sản phẩm chính cao, khả năng thích nghi nhanh, tốc độ sinh trưởng mạnh, điều kiện nuôi cấy đơn giản).
- Chọn môi trường nhân sinh khối phù hợp nhất (vi khuẩn nội sinh, sinh trưởng và phát triển tốt, rẻ tiền, dễ tìm).
- Chọn các điều kiện nhân sinh khối tốt nhất như (nhiệt độ, tốc độ lắc, thời gian nhân sinh khối).
- Nhân sinh khối và thu hồi sinh khối
- Bảo quản chế phẩm: Chế phẩm VK nội sinh sau khi sản xuất được bảo quản trong can 20 lít, 50 lít... để ở nhiệt độ 250C trong vòng 40 ngày.
Phương pháp đánh giá chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản:
Đánh giá sự thay đổi mật độ tế bào của chế phẩm VK nội sinh sau thời gian bảo quản 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày:
Đếm số lượng khuẩn lạc ở các thời gian bảo quản khác nhau bằng phương pháp pha loãng tới hạn (Nguyễn Lân Dũng và Phạm Văn Ty, 1998)[6].