Chương 2: ĐỐI TƯỢNG - ĐỊA ĐIỂM - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn nội sinh để kích kháng bệnh khô cành ngọn Keo tai tượng
2.3.4.1. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi khuẩn nội sinh đến nảy mầm hạt giống
Thí nghiệm đối với sự nẩy mầm của hạt được tiến hành với 16 công thức 3 lần lặp tại phòng thí nghiệm của Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. Chọn các hạt Keo tai tượng tốt, chắc, loại bỏ hạt lép và tạp chất, cân đều vào 9 cốc, mỗi cốc 1,5g ghi tên. Ngâm tất cả các hạt trong nước sôi trong vòng 1 phút sau đó rửa sạch.
Lấy dịch khuẩn nội sinh trong bình lắc ra, cho vào 15 cốc với các mẫu tương ứng với các mật độ vi khuẩn nội sinh (6.109, 6.107, 6.105) ngâm trong 2 giờ, sau đó rửa lại bằng nước cất và để ráo nước. Công thức đối chứng làm tương tự nhưng đối với nước cất. Cho 15 cốc hạt và 1 cốc đối chứng vào mỗi hộp lồng tương ứng đã được khử trùng và lót giấy ẩm, để ở tủ nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 280C độ ẩm 85%, giờ chiếu sáng là 12 giờ/ngày. Theo dõi sự nảy mầm của hạt sau 8 ngày với công thức:
PNM%= x100 N
n
Trong đó PNM%: Tỷ lệ nảy mầm của công thức, n: Số hạt nảy mầm N: Số hạt có trong công thức.
Các hạt đã được nhiễm các chủng VK nội sinh ở các nồng độ khác nhau sau khi nảy mầm được tra vào bầu, 60 ngày sau tiến hành phun nấm gây bệnh (C.
gloeosporioides) tiếp tục theo dõi các công thức trong vòng 30 ngày để đánh giá về sinh trưởng thông qua chiều cao vút ngọn (Hvn) và đường kính gốc (Do), tỷ lệ bị bệnh và cấp bị bệnh theo phương pháp của (Old et al., 2000)[86].
Để đánh giá ảnh hưởng của VK nội sinh đến khả năng sinh trưởng và kháng nấm bệnh của cây con trong giai đoạn vườn ươm.
2.3.4.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi khuẩn nội sinh đến kích kháng bệnh khô cành ngọn Keo tai tượng trong giai đoạn vườn ươm
Thí nghiệm thử các phương thức, liều lượng nhiễm VK nội sinh đối với cây Keo tai tượng trong giai đoạn vườn ươm được tiến hành với 5 chủng có hiệu lực kháng nấm C. gloeosporioides cao, mật độ vi khuẩn nội sinh 6.109 cfu/ml bằng 3 phương thức nhiễm, mỗi công thức thí nghiệm 40 cây, 3 lần lặp các công thức được xử lý bằng phần mềm GENTAT 5 và Dataplus 3.0.
Tiêm dịch trực tiếp vào cây: Được tiến hành với 16 công thức (CT1- CT16) bằng cách tiêm theo phương pháp thẩm thấu lần lượt dịch từng chủng VK nội sinh ở 3 mức 1, 2 và 3 ml/cây, công thức đối chứng (ĐC) tiêm 2 ml nước cất.
Phun dịch trực tiếp vào cây: Được tiến hành với 16 công thức (CT1- CT16) bằng cách phun lần lượt dịch 5 chủng VK nội sinh ở 3 mức 3, 6 và 9 ml/cây, công thức ĐC1 phun 6ml nước cất.
Tưới dịch trực tiếp vào cây: Được tiến hành với 16 công thức (CT1- CT16) bằng cách tưới lần lượt dịch 5 chủng VK nội sinh ở 3 mức 3, 6 và 9 ml/cây công thức đối chứng tưới 6 ml nước cất.
Sau 2 tuần tiến hành phun ướt toàn bộ cây ở các công thức thí nghiệm bằng dung dịch nấm C. gloeosporioides có mật độ 1.105 cfu/ml và tạo môi trường thuận lợi cho cây và nấm bệnh phát triển (10 ngày).
Theo dõi trong vòng 1 tháng để đánh giá tỷ lệ bị bệnh, mức độ bị bệnh và sinh trưởng của cây bằng cách đo chiều cao vút ngọn (Hvn), đường kính gốc (Do) ở các công thức khác nhau.
2.2.4.3. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi khuẩn nội sinh đến kích kháng bệnh khô cành ngọn Keo tai tượng ở giai đoạn cây 1 năm tuổi
Từ các thí nghiệm ở giai đoạn vườn ươm ta chọn lấy 2 chủng VK nội sinh có tác dụng tốt nhất để nghiên cứu liều lượng nhiễm cho cây Keo tai tượng ở giai đoạn một tuổi. Thí nghiệm ứng dụng VK nội sinh đối với Keo tai tượng 1 năm tuổi được tiến hành tại vườn ươm của Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam (phường Đức Thắng, quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội) với 12 công thức (CT1-CT12) bằng cách tưới lần lượt dịch VK nội sinh với mật độ 6.109 cfu/ml (2 chủng) ở 5 mức độ khác nhau (20ml/cây, 40ml/cây, 60ml/cây, 80ml/cây, 100ml/cây,) công thức ĐC1 tưới 80 ml nước cất. Công thức ĐC2 phun thuốc hóa học có hiệu lực tốt nhất trong phòng thí nghiệm, mỗi công thức 30 cây, 3 lần lặp thời gian theo dõi trong vòng 6 tháng số liệu được xử lý bằng phần mềm GENTAT 5 và Dataplus 3.0.
Sau 30 ngày nhiễm VK nội sinh, phun ướt toàn bộ cây thí nghiệm ở các công thức bằng dung dịch nấm gây bệnh có mật độ 1.105 tế bào/1ml. Sau đánh giá tỷ lệ bị bệnh và mức độ bị bệnh ở các công thức thí nghiệm.
Ảnh hưởng của VK nội sinh đến sinh trưởng (chiều cao, khối lượng tươi, khối lượng khô) của Keo tai tượng ở các công thức thí nghiệm.
- Tiến hành đo Hvn bằng thước chuyên dùng, đường kính D1.3 các cây có trong công thức.
- Keo tai tượng ở các công thức khác nhau sau khi nhiễm chế phẩm 6 tháng tiến hành thu riêng rẽ từng công thức gồm (thân, cành, lá) tươi đem cân được sinh khối tươi.
- Sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 750C trong khoảng thời gian từ 6 - 8 giờ.
Trong quá trình sấy, kiểm tra trọng lượng của mẫu sau 2, 4, 6 và 8 giờ sấy. Nếu sau 3 lần kiểm tra thấy trọng lượng không đổi thì đó chính là trọng lượng khô của mẫu, số liệu được xử lý bằng phần mềm GENTAT 5 và Dataplus 3.0.
Chương 3