Chương 2: ĐỐI TƯỢNG - ĐỊA ĐIỂM - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn nội sinh và khả năng đối kháng với nấm gây bệnh
2.3.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh và đánh giá khả năng đối kháng với nấm gây bệnh
Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh
Để phân lập VK nội sinh cần chuẩn bị môi trường sau:
Môi trường PBS:
NaCl : 8,5 gam
KH2PO4 : 6,8 gam
NaOH : 1,16 gam
Nước cất : 1000 ml Điều chỉnh pH : 7
Sau khi pha được môi trường cho vào các ống nghiệm, các ống nghiệm cần phải nút bông chặt và miệng ống nghiệm được quấn bằng giấy, mỗi ống nghiệm 9ml, hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 30 phút.
Môi trường PDA:
Khoai tây :200 gam D-Glucose :20 gam
Agar :15-18 gam
Nước cất :1000ml
Khoai tây rửa sạch cắt thành miếng có kích thước 1x1x1cm cho vào nồi và đổ nước 1000 ml đun sôi, để 30 phút tính từ lúc sôi, lọc lấy nước trong, sau đó cho thêm nước cho đủ 1000 ml. Cho D-glucose và agar vào các bình tam giác 500 ml nút bông, quấn giấy đầu cổ bình (3 bình, mỗi bình 330 ml). Hấp khử trùng ở môi trường 1210C trong 30 phút rồi đổ ra hộp lồng để trong tủ cấy.
Cắt mẫu: Lấy cành mẫu đã được chọn cắt thành từng đoạn nhỏ khoảng 7- 8 cm, khử trùng bằng cồn 75% trong 1 phút. Lấy ra hơ nhanh qua đèn cồn, sau đó cắt thành các lát mỏng có kích thước 0,5 - 1,0 (mm) ở 3 vị trí: phần vỏ (Bark) ký hiệu
là B; phần tượng tầng (Phloem) ký hiệu là P; phần gỗ (Xylem) ký hiệu là X. Sau khi cắt xong cân mỗi phần 1 gam rồi cho vào ống nghiệm có chứa môi trường PBS nút bông và bịt miệng ống nghiệm bằng giấy để qua đêm.
Phân lập: Vi khuẩn nội sinh phân lập theo phương pháp pha loãng tới hạn.
Dùng pipet lấy 1ml cho vào hộp lồng có chứa môi trường PDA, dùng que trang đều trên mặt thạch và ghi rõ ngày cấy và ký hiệu mẫu bệnh. Để các hộp lồng đã cấy VK nội sinh trong tủ định ôn ở nhiệt độ 280C, theo dõi sự xuất hiện của các khuẩn lạc đếm số lượng VK nội sinh có trong hộp lồng, có bao nhiêu chủng khác nhau, mô tả đặc điểm của mỗi chủng. Nếu mật độ VK nội sinh quá nhiều trên mỗi hộp lồng cần pha loãng đến 10-5, 10-6. Dùng que cấy tách ra từng chủng VK nội sinh khác nhau rồi cho ra một hộp lồng khác có chứa môi trường PDA (mỗi hộp một loại VK nội sinh), mỗi chủng cấy 5 hộp lồng, sau đó dùng băng keo quấn chặt. Theo dõi sự phát triển của VK nội sinh và đánh giá khả năng sinh trưởng của VK nội sinh, mô tả đặc điểm của VK nội sinh khi nó được tách ra. Dựa vào hình thái, màu sắc, kích thước để nhận biết các loại VK nội sinh khác nhau và được thống kê các chủng phân lập được từ các mẫu thí nghiệm.
Đánh giá khả năng đối kháng với nấm gây bệnh
Các chủng VK nội sinh sau khi phân lập thuần được cấy chính giữa trên các đĩa môi trường PDA, để ở nhiệt độ 280C sau đó cấy nấm C. gloeosporioides thành 3 điểm vào sát mép của đĩa Petri. Sau 5-7 ngày đánh giá hiệu lực kháng nấm bệnh của vi khuẩn trên môi trường PDA bằng việc đo đường kính vòng kháng. Đường kính vòng kháng được tính bằng công thức sau:
V (mm) = D (mm) – d (mm)
Trong đó: D là đường kính trung bình vòng kháng sự phát triển của nấm bao quanh khuẩn lạc tính theo 2 chiều vuông góc, d là đường kính trung bình tính theo 2 chiều vuông góc của khuẩn lạc.
Căn cứ vào trị số V, xác định được chủng vi khuẩn có hiệu lực kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides. Hiệu lực kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn nội sinh phân thành 5 cấp như sau:
Hiệu lực kháng rất mạnh (++++) : Đường kính vòng kháng V≥ 20mm
Hiệu lực kháng mạnh (+++) : Đường kính vòng kháng 10mm ≤V<20mm Hiệu lực kháng trung bình (++) : Đường kính vòng kháng 5mm ≤V<10mm Hiệu lực kháng yếu (+) : Đường kính vòng kháng 1mm ≤V<5mm Không có hiệu lực (-) : Đường kính vòng kháng V<1mm
2.3.2.2. Đặc điểm hình thái và định danh vi khuẩn nội sinh có hoạt tính đối kháng cao Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái
Đặc điểm hình thái VK nội sinh có hoạt tính cao như: hình dạng, màu sắc, kích thước khuẩn lạc được mô tả theo (Nguyễn Lân Dũng và Phạm Văn Ty, 1998)[6].
Quan sát mô tả đặc điểm tế bào sinh dưỡng, bào tử các chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính đối kháng nấm bệnh cao dựa trên kính hiển vi quang học BX50 Olympus, có độ phóng đại 2000 lần.
Phương pháp định danh VK nội sinh
- Giám định VK nội sinh có hiệu lực kháng nấm gây bệnh khô cành ngọn Keo tai tượng bằng phương pháp sinh học phân tử.
Tách chiết ADN: VK nội sinh được nuôi cấy 2 ngày trên môi trường thích hợp. Lấy 1 vũng que cấy tế bào vào ống eppendorf vụ trựng, thờm 500 àl 2ìSSC vào mỗi ống. Lắc đều và giữ ở 990C trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 1 lần bằng nuớc cất vô trùng. Thêm khoảng 100 àl hạt thủy tinh cú đường kớnh 0,2 - 0,5 mm (Roth, Đức), 100 àl dung dịch phenol/chloroform (tỉ lệ 1:1) và 100 àl nước cất vụ trựng. Lắc ở 1400 vòng/phút trong 10 phút trên máy Thermocomfort (Eppendorf, Đức) sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía trên có chứa ADN làm khuôn cho phản ứng PCR. ADN sau khi tách chiết được giữ ở -200C.
Định tên vi khuẩn nội sinh bằng giải trình tự nucleotide: Phân đoạn 16S rADN của vi khuẩn nội sinh được phản ứng trên thiết bị GeneAmp® PCRSystem 9700 (PE Applied Biosystem, Mỹ) sử dụng cặp mồi 16S-8F (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’) và 16S1510R (5’-GGCTACCTTGTTACGA-3’). Chương trình nhiệt được thiết lập
với pha biến tính ở 940C trong 2 phút kế tiếp là 35 chu kỳ nhiệt (940C trong 30 giây, 520C trong 30 giây và 720C trong 1 phút). Quá trình phản ứng được hoàn tất ở 720C trong 7 phút và sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở 100C. Sản phẩm PCR sau khi phản ứng được tinh chế bằng QIAEX II (Qiagen, Đức) theo khuyến cáo của hãng.
Trình tự ADN được đọc bằng phương pháp “dideoxy chain termination” với việc sử dụng kit AmpliTaq (Amersham) theo hướng dẫn của hãng. Máy đọc trình tự, model 377 của hãng Applied Biosystem được sử dụng. Các chuỗi ADN được so sánh với GeneBank thông qua giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide-nucleotide đặt tại National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Mỹ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Các chuỗi liên quan được chuyển tải về sau đó xử lý bằng phần mềm BioEdit và so sánh bằng ClustalX (Thompson et al., 1994)[105].
Cây tiến hóa được hiển thị bằng phần mềm TreeExplorer.
2.3.2.3. Vi khuẩn nội sinh kích kháng bệnh đốm lá khô cành ngọn Keo tai tượng - Phương pháp xác định thành phần và mật độ vi khuẩn nội sinh ở cây chủ với các cấp bị bệnh khác nhau:
+ Xác định thành phần các chủng VK nội sinh dựa vào hình dạng, màu sắc, kích thước, khả năng sinh trưởng của chúng.
+ Xác định mật độ VK nội sinh ở cây chủ với các cấp bị bệnh khác nhau:
Lấy 1ml dung dịch VK nội sinh của mỗi chủng pha loãng với 9 ml nước cất đã hấp khử trùng theo phương pháp pha loãng tới hạn. Lấy 1 ml dịch khuẩn đã pha loãng trang trên 3 hộp lồng chứa môi trường PDA. Đặt các hộp lồng đã cấy trong tủ định ôn ở 280C trong 48 giờ. Đếm số lượng khuẩn lạc thu được trên các hộp lồng tính theo CFU/ml.
- Thí nghiệm invitro
Năm (5) chủng VK nội sinh có hoạt tính cao, nhân sinh khối riêng rẽ trên môi trường PDA không agar. Pha loãng dịch nuôi cấy đạt mật độ 109 cfu/ml và ba (3) loại thuốc là: ridomil 72WP, carbenzim 50WP, và anvil 5SC. Nồng độ pha lần lượt như sau ridomil nồng độ 0,5%, carbenzim 50WP nồng độ 0,3%, và anvil 5SC với nồng độ 0,25%.
Thí nghiệm được tiến hành với 9 công thức: 5 công thức với VK nội sinh, 4 công thức đối chứng trong đó 3 công thức với thuốc hóa học và 1 công thức đối chứng là nước cất. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành với 10 đĩa Petri và thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Đục một lỗ có đường kính 1 cm ở giữa đĩa Petri, cấy nấm ở 3 điểm góc đĩa tạo thành một hình tam giác. Dùng pipét hút 1ml dịch VK nội sinh và thuốc hóa học đã pha theo đúng nồng độ cho vào lỗ đục, băng kín và để ở tủ định ôn ở nhiệt độ 280C. Sau 24 và 48 giờ kiểm tra và đo vòng kháng nấm của thuốc so với đối chứng. Xử lý số liệu bằng phần mềm excel 9.0 (Nguyễn Hải Tuất, 2003)[36].
- Phương pháp thí nghiệm cành và lá non Keo tai tượng
Thí nghiệm được tiến hành với 9 công thức, năm (5) công thức với 5 chủng VK nội sinh có hoạt tính cao, nhân sinh khối riêng rẽ trên môi trường PDA không agar. Pha loãng dịch nuôi cấy đạt mật độ 109 cfu/ml và 4 công thức đối chứng (1 nước cất và 3 thuốc hóa học). Lấy cành, lá non Keo tai tượng không bị bệnh nhúng vào 1 trong 9 cốc đựng dung dịch (5 cốc VK nội sinh có hiệu lực cao, 3 cốc đựng thuốc hóa học ridomil nồng độ 0,5%, carbenzim 50WP nồng độ 0,3%, và anvil 5SC với nồng độ 0,25%, 1 cốc nước cất) trong vòng 3 phút, mỗi công thức có 10 hộp lồng, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Lấy bào tử từ cơ quan sinh sản của nấm đã nuôi cấy trên môi trường PDA bằng que cấy được khử trùng trên ngọn đèn cồn, cho bào tử nấm vào cốc nước vô trùng tới khi mật độ đạt 1.105 tế bào/ml. Sau đó để lá vào trong hộp lồng petri giữ ẩm, mỗi hộp để 3 lá. Tiến hành phun bào tử nấm lần lượt vào các đĩa petri, băng keo lại xung quanh hộp, để ở nhiệt độ 280C. Theo dõi trong vòng 6 ngày và đánh giá mức độ bị bệnh ở mỗi công thức.
2.3.2.4. Một số đặc điểm sinh học khác của vi khuẩn nội sinh - Phương pháp nghiên cứu khả năng tạo hoóc môn thực vật
Năm chủng VK nội sinh có hiệu lực kháng bệnh cao được nhân sinh khối trên môi trường King’ B không agar, tốc độ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C trong 48h (môi trường King’ B không agar có bổ sung trytophan 0,1%). Lấy 2ml dịch VK
nội sinh đã ly tâm 3000 vòng/phút và bổ sung thêm 8ml thuốc thử Salkowski cải tiến sẽ cho màu hồng nhạt đến đỏ phụ thuộc vào hàm lượng IAA thô được sinh ra.
Hàm lượng IAA thô sinh ra được xác định theo phương pháp so màu với bước sóng 530 nm với đồ thị chuẩn IAA.
Dựng đồ thị chuẩn IAA: Cân 0,025g IAA cho vào cốc đong có chứa sẵn 50ml nước cất và đun cho tan IAA. Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa sẵn 10ml nước cất trong mỗi ống. Hút ở mỗi ống nghiệm lần lượt 0, 50, 100, 200, 400, 600,..., 1400, 1600 àl nước cất đồng thời bổ sung lượng IAA tương ứng với lượng nước cất hút ra ở mỗi ống nghiệm. Đối chứng là 2ml nước cất bổ sung 8ml thuốc thử. Dựa vào chỉ số OD (mật độ quang) và nồng độ IAA trong dung dịch để dựng đồ thị chuẩn IAA tinh khiết. Thêm 2ml dung dịch vi sinh vật đã ly tâm vào ống nghiệm đã có sẵn 8ml thuốc thử. Đối chứng là 2ml môi trường và 8ml thuốc thử. So màu trên máy so màu bước sóng 530 nm và tính kết quả theo đồ thị chuẩn IAA tinh khiết.
- Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải phốt phát khó tan + Thí nghiệm định tính
Năm (5) chủng VK nội sinh có hiệu lực cao (LC, KPT, P01, X02, B03) mỗi chủng cấy vào 10 đĩa Petri có chứa môi trường Pikovskaya, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Môi trường Pikovskaya:
Ca3(PO4)2 : 0,5 g
Sacarose : 10 g
(NH4)2SO4 : 0,5 g
NaCl : 0,2 g
MgSO4.7H2O : 0,1 g
KCl : 0,2 g
Cao nấm men : 0,5 g
MnSO4 : Vết
FeSO4 : Vết
Agar : 20 g
Nước : 1 lít
pH : 7
Cấy VK nội sinh lên môi trường Pikovskaya, nuôi trong tủ định ôn ở nhiệt độ 280C thời gian nuôi cấy 8 ngày. Tiến hành đo đường kính vòng phân giải lân theo 2 chiều vuông góc. Hiệu lực của vòng phân giải được đánh giá thông qua đường kính vòng phân giải (DTB): Hiệu lực thấp: DTB ≤ 5mm, Hiệu lực trung bình:
5mm <DTB ≤ 10mm, Hiệu lực cao: DTB > 10mm.
+ Phương pháp xác định hàm lượng lân dễ tiêu do VK nội sinh phân giải:
Lần lượt từng chủng VK nội sinh được nuôi cấy thuần khiết đưa vào nuôi trong môi trường Pikovskaya không agar đã khử trùng và tiến hành lắc ở 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 280C, trong 120 giờ. Ly tâm dịch ở 5000vòng/ phút trong 20 phút để lọc bỏ vi khuẩn phân giải lân lấy dịch trong, so màu ở bước sóng 430nm.
Dung địch đối chứng là môi trường Pikovskaya không có agar.
Dựng đường chuẩn P2O5: Từ dung dịch chuẩn hút vào mỗi bình định mức 100 ml với các thể tích khác nhau như sau: 2 ml, 4 ml, 6ml, 8 ml (tương ứng với 0,02 mg, 0,04 mg, 0,06 mg, 0,08 mg P2O5). Thêm nước cất 2 lần vào các bình đựng trên đến thể tích xấp xỉ 50ml và lắc đều. Một bình định mức làm đối chứng chỉ có nước cất. Thêm vào các bình định mức trên mỗi bình 2 ml dung dịch amoni molipdat và 3ml dung dịch axit ascobic 1% sau đó lắc đều. Đặt tất cả các bình lên bếp cách thủy đun trong 15 phút. Trong quá trình đun sẽ xuất hiện phức màu xanh molipden. Để nguội và dẫn nước cất đến vạch định mức. Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy so màu có bước sóng α = 650 nm. Xử lý kết quả sau khi đo ta sẽ nhận được đồ thị chuẩn P2O5.