Chương 1. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.4. Tình hình nghiên cứu về chế phẩm sinh học trên thế giới và Việt Nam
1.4.3. Các nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus trên thế giới và ở Việt Nam
Trong tự nhiên nhiều loài vi sinh vật có khả năng ức chế sinh trưởng của các loài sinh vật khác và chúng được gọi là vi sinh vật đối kháng. Việc sử dụng hiện tượng đối kháng này trong công tác bảo vệ thực vật được gọi là biện pháp phòng trừ sinh học. Hướng phòng trừ này đã và đang được nhiều các nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu và cho ra các chế phẩm có nhiều triển vọng.
Đây là một trong những phương pháp phòng chống dịch hại có hiệu quả.
Các loại vi khuẩn đối kháng đều thuộc hệ vi sinh sống ở vùng rễ cây trồng và sống hoại sinh trong đất. Trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu hiệu lực của vi khuẩn đối kháng với các tác nhân gây bệnh cây (do vi khuẩn và nấm). Kết quả nghiên cứu cho thấy các loài vi khuẩn đối kháng có thể bảo vệ cây trồng, chống lại các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt (Weller, 1988)[62].
Theo Vos, Garrity, Jones (2009)[30] Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mô tả trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ 19. Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, có khả năng sinh nội bào tử để chống chịu các điều kiện bất thường của môi trường sống. Bacillus phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên: từ trên cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn và từ vùng ven bờ đến đáy các Đại Dương.
Theo Krebs et al. (1998)[52],[70] Một số dòng Bacillus thuộc nhóm B.
subtilis, Bacillus amyloliquefaciens phân lập từ đất nhiễm mầm bệnh thực vật có hoạt động thúc đẩy tăng trưởng thực vật.
Một số nghiên cứu cho rằng: Sử dụng các chủng vi khuẩn Bacillus (B.
subtilis, B. megaterium, và B. firmis) làm tăng khả năng nảy mầm của hạt giống, rễ,chiều dài cành, trọng lượng khô và năng suất của lạc. Tuy nhiên không có tương quan giữa hiệu quả và khả năng của các vi khuẩn này để hòa tan lân và sản xuất auxin[34].
1.4.3.1. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus subtilis
Trong các vi khuẩn có ích, Bacillus là một trong những vi sinh vật được nghiên cứu ứng dụng nhiều, đặc biệt là trong ứng dụng phòng trừ bệnh hại cây trồng. Chủng Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm 1872[7]. Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram dương, kích thước (3÷5) × 0.6 μm, có khả năng sinh bào tử và là loài sinh vật tự dưỡng, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi nên có nhiều ưu thế trong khả năng chế tạo ra chế phẩm sinh học có thời gian bảo quản lâu dài[10]. Hạt lạc được nhiễm bằng dung dịch huyền phù của vi khuẩn Bacillus subtilis làm tăng số lượng nốt sần, hạn chế bệnh héo rũ gốc mốc trắng[69].
Theo Kennedy et al (1997)[51] vi khuẩn Bacillus có thể kết hợp với vi khuẩn Pseudomonas để hạn chế bệnh héo rũ gốc mốc trắng và nâng cao năng suất lạc.
Theo Glick et al (1995),[46],[65]. Hệ enzyme của Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase. Bacillus subtilis đã được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp, nhất là công nghiệp sản xuất enzyme như protease, amylase.
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về ứng dụng của Bacillus subtilis trong chế biến thực phẩm, trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc[13]. Cùng với Bacillus subtilis, hệ enzyme cellulase cũng được nghiên cứu từ lâu[16]. Enzyme này là một phức hệ gồm nhiều enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa cellulose[44],[46]; Enzyme exoglucanase hay C1; Enzyme endogluconase hay Cx; Enzyme -1,4-glucosidase.
Bacillus là vi khuẩn gam dương và catalase dương tính, sử dụng khi oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Qua kính
hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu.
Thường thì người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng.
Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Bích Lợi (2014)[12]. Một số chủng vi khuẩn Bacillus thể hiện các hoạt động ngăn chặn tác nhân gây bệnh hoạt tử, ký sinh trùng hoặc thúc đẩy tăng trưởng thực vật. Cải thiện sức khỏe cây trồng và năng suất được thể hiện bởi ba cơ chế sinh thái khác nhau: sự đối kháng của sâu bệnh và tác nhân gây bệnh, thúc đẩy dinh dưỡng cây trồng và tăng trưởng và kích thích sự bảo vệ cho cây.
Một số loài vi khuẩn Bacillus sản xuất độc tố làm ức chế sự tăng trưởng và các hoạt động của nấm gây bệnh trong đó nghiên cứu rõ nhất là các loài B.
subtilis (Pinchuk et al., 2002)[57]. Ngoài ra, một số nghiên cứu đã báo cáo sự đối kháng trực tiếp của một số loài khác bao gồm Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus lichenformis, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus pumilus cùng với các chủng loài không xác định từ các chi (Yu et at., 2002)[48].
Enzym dị hóa (viz., protease, chitinases và glucanase), kháng sinh peptides, và các phân tử nhỏ có thể được tiết ra bởi các loài khác nhau và góp phần ức chế tác nhân gây bệnh. Kháng sinh peptides và một số hợp chất khác gây độc hại đối với tác nhân gây bệnh đã được thu thập từ một số chủng vi khuẩn Bacillus (Yu et al., 2002)F[48]. Chủng B.subtilis sản xuất thuốc kháng sinh lipopeptide iturin A và sufactin có thể ngăn chặn bệnh héo rũ hại lạc. Sự đối kháng cũng đóng vai trò, trong đó có việc cạnh tranh trong không gian thích hợp và các chất dinh dưỡng với chemoheterotrophs khác, trong đó dòng phytosphere di động hơn và chemotactic của B.mgaterium được hiển thị để cư trú tốt hơn ở vùng rễ và ngăn chặn R.solasi (Zheng và Simclair, 2000)[63].
Theo Priest (1993)[58] Quần thể vi khuẩn cũng có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách kích thích cây chủ hoặc vật cộng sinh hỗ cộng sinh.
Cây trồng chủ cũng có thể bị ảnh hưởng bởi kích thích tố được sản xuất bởi các
loài vi sinh vật khác nhau bao gồm B.subtilis. Theo M Toro (1997)[54] B.subtilis hòa tan phosphate đã được nghiên cứu để làm tăng lượng đạm và tích tụ phosphate khi đồng chủng với nấm rễ Glomus intraradices .
- Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với vi sinh vật gây bệnh
Mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp với điều kiện môi trường khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau.
Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi tức là thay đổi điều kiện sống sẽ hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh không gian giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận, 1976)[18].
Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXB Giáo dục.
Phương thức diệt nấm và các tác nhân gây bệnh của vi khuẩn Bacillus subtilis như sau:
Đầu tiên vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành khối xung quanh tác nhân gây bệnh ngăn chặn không cho chúng bám vào vật chủ để gây bệnh. Sau đó Bacillus bubtilis tiết ra hỗn hợp gồm nhiều lipopeptid (được gọi là serenade) để làm thủng vách tế bào và màng tế bào chất của tác nhân gây bệnh do đó ngăn chặn 1.4.3.2. Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens
B. amyloliquefaciens được Fukomoto phát hiện vào năm 1943 nhờ khả năng sinh α-amylase và protease[45]. Thời gian đầu, loài vi khuẩn này được xem là dòng khác của B. subtilis hay loài phụ B. Subtilis, B. amyoliquefaciens. B.
amyloliquefaciens mang rất nhiều đặc điểm tương đồng với các loài B. subtilis, B. licheniformis và B. pumilus. Bằng các phương pháp phân loại thông thường rất khó để phân biệt giữa chúng. Đến năm 1987, B. amyloliquefaciens mới được tách ra thành một loài riêng.
Từ đó đến nay, nhiều chủng B. amyloliquefaciens phân lập từ các hệ sinh thái khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau đã được công bố. Năm 2010, Borriss
et al đã đề xuất tách B. amyloliquefaciens thành 2 nhóm loài phụ là B.
amyloliquefaciens có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật và B.
amyloliquefaciens không có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật[36].
Theo Richard, Murray (2009)[59] Loài vi khuẩn này được biết đến từ rất sớm nhờ khả năng sản sinh các loại enzyme ngoại bào đa dạng. Từ những năm 1943, B. amyloliquefaciens đã được sử dụng để sản xuất 2 loại enzyme công nghiệp là α-amylase và protease.
Kết quả nghiên cứu của Benitez et al (2012)[32] cho rằng enzyme từ B.
amyloliquefaciens như amylase, xylanase, cellulase, protease và lipase có nhiều đặc tính quý như khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và khả năng bền nhiệt. Do đó, enzyme từ B. amyloliquefaciens đã được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp giấy và công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa.
Theo Sanders (2008)[61] các loài thuộc nhóm B. subtilis đã được biết đến nhờ khả năng sinh các chất kháng sinh kháng vi khuẩn và nấm gây bệnh hoặc sản sinh các sản phẩm trao đổi bậc hai khác như chất kháng virus, chất kháng ung thư và chất ức chế miễn dịch. Chất kháng sinh từ Bacillus có bản chất là các peptide được tổng hợp qua ribosome hay không qua ribosome đều đã được công bố từ loài B. amyloliquefaciens.
Một số chủng B. amyloliquefaciens sống nội cộng sinh trên rễ cây thực vật có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng Indole-3-acetic axít (IAA). Chất này sẽ tác động tích cực đến những quá trình sinh lý của thực vật như quang hướng động, địa hướng động, ưu thế chồi ngọn và sự tượng rễ.
B. amyloliquefaciens là những vi sinh vật an toàn (Generally recognized as safe; GRAS) và có thể dùng như probiotics để bổ sung vào thức ăn hoặc nước uống nhằm cân bằng hệ vi sinh đường ruột, qua đó ngăn ngừa và phòng chống các bệnh tiêu chảy thường gặp[71].
Một số chủng B. amyloliquefaciens có thể làm giảm chất phytate ngoại bào (myo-inositol hexakisphosphate). Những thử nghiệm di truyền và sinh hóa cung cấp bằng chứng mạnh mẽ cho thấy hoạt tính của phytaza B.
amyloliquefaciens là điều quan trọng cho kích thích tăng trưởng thực vật dưới giới hạn phosphate[70].
Chương 2