Xác định hàm lượng anthocyanin

7.2 Các phương pháp phân tích

7.2.12 Xác định hàm lượng anthocyanin

Hàm lượng anthocyanin được xác định theo phương pháp của Lavelli và cộng sự (2016) [83].Hàm lượng anthocyanin được biểu thị dưới dạng tương đương cyanidin-3-glucoside (CY-3-Glu).

Hóa chất

- Đệm pH 1 (KCl, 0,025M): cân 1,86g KCl vào cốc, hòa tan bằng nước cất đến 980mL, đo pH, chỉnh về pH 1,0 (±0,05) với HCl. Sau đó định mức lên 1 lít bằng nước cất.

Trình tự tiến hành

Bơm 1 lượng dịch trích nhất định vào ống nghiệm được bọc kín tránh ánh sáng và đệm pH 1 (lượng dịch trích không vượt quá 20% tổng thể tích tổng dịch trích

& đệm), ủ ở nhiệt độ phòng, sau 15 phút đo ở 2 bước sóng 520 và 700nm.

Tính toán kết quả

Nồng độ anthocyanin trong dịch trích được tính toán thông qua công thức:

TA (mg/mL) = [(A520nm – A700nm) × 449,2 × DF × 1000]/(α × 1)

Với 449,2 = khối lượng phân tử của CY-3-Glu; 1000 = chuyển đơn vị từ g sang mg;

α(hệ số mol của CY-3-Glu) = 26.900 L/mol.cm; DF = độ pha loãng mẫu (không thứ nguyên)

7.2.13 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa theo FRAP (Ferric reducing antioxidant power)

Hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu dịch trích theo phương pháp FRAP được xác định dựa trên phản ứng chất kháng oxy hóa cho điện tử phức [Fe(III)-(TPTZ)2]3+

(2,4,6 – tri – 2 – pyridyl – 1,3,5 – triazine) có màu nâu nhạt tạo thành phức [Fe(II)- (TPTZ)2]2+ (2,4,6 – tri – 2 – pyridyl – 1,3,5 – triazine) có màu xanh đậm, độ hấp thu cực đại ở bước sóng 593 nm [57, 84]. Đo độ hấp thu của mẫu cần phân tích, kết hợp với đồ thị đường chuẩn được dựng theo FeSO4, chúng ta xác định được hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu cần phân tích với đơn vị tính là mol đương lượng FeSO4/g chất khô nguyên liệu (mol FeSO4/g chất khô nguyên liệu) [52].

70 Hóa chất

- Thuốc thử FRAP:

Dung dịch R2: Đệm acetate 300 mM, pH = 3,6 (Cân 3,1 g C2H3NaO2.3H2O và hút 16 mL CH3COOH, định mức lên 1 lít bảo quản ở nhiệt độ phòng).

Dung dịch R3: HCL 40 mM (Hút 3,942 mL HCl 37% định mức lên 1 lít bằng nước cất, bảo quản ở nhiệt độ phòng)

Dung dịch R4: TPTZ (2,4,6 –tri(2-pyridyl-s-triazine) 10 mM (Cân 0,078 g TPTZ định mức lên 25 mL bằng R3, pha dùng trong ngày)

Dung dịch R5: FeCL3.6H2O 20 Mm (Cân 0,540 FeCl3.6H2O định mức lên 100 mL bằng nước cất, pha dùng trong ngày)

Thuốc thử FRAP được chuẩn bị bằng cách pha các dung dịch trên theo tỉ lệ:

R2:R4:R5 = 10:1:1. Dung dịch FRAP pha dùng trong ngày.

- Dung dịch FeSO4 nồng độ chuẩn 500 àM : Cõn 0,139g FeSO4.7H2O và định mức lên 1L bằng nước cất.

Trình tự tiến hành Dựng đường chuẩn

Pha loãng dung dịch chuẩn FeSO4 ở nồng độ 500 μM thành các dung dịch nồng độ 0, 100, 200, 300, 400 μM.

Cho 0,6 mL dung dịch FeSO4 ở các nồng độ vào ống nghiệm. Tiếp tục cho 3,4 mL dung dịch FRAP đã pha ở trên vào mỗi ống. Lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối 1h. Đo độ hấp thu tại bước sóng 593 nm. Dựng đường chuẩn nồng độ FeSO4 (àM) theo độ hấp thu.

Đường chuẩn thu được như Hình 7.6 :

Nồng độ FeSO4 (mM) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

OD 0 0,253 0,489 0,789 1,089 1,342

Hình 7.6 Đường chuẩn xác định hoạt tính kháng oxy hóa theo FRAP Chuẩn bị mẫu phân tích

Pha loãng dịch trích mẫu bằng nước dung môi trích ly theo tỉ lệ thích hợp sao cho độ hấp thu nằm trong đường chuẩn. Các bước tiếp theo thực hiện tương tự như cách xây dựng đường chuẩn nhưng thay dung dịch chuẩn FeSO4 bằng mẫu đã pha loãng.

Mẫu Blank: thực hiện tương tự nhưng thay bằng dung môi trích ly.

Tính toán kết quả

Từ đồ thị đường chuẩn và độ hấp thu của mẫu, ta xác định được hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu phân tích. Kết quả được tính theo đương lượng FeSO4 (μmol FeSO4/g nguyên liệu)

7.2.14 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) Hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu dịch trích theo phương pháp DPPH được xác định dựa trên phản ứng của các chất kháng oxy hóa có trong mẫu thử với gốc DPPH (hay còn gọi là sự dập tắt các gốc DPPH). DPPH là một gốc tự do chứa nitơ, ổn định, có màu tím. Độ hấp thu cực đại của DPPH trong ethanol hoặc methanol được ghi nhận tại bước sóng 517nm hoặc 515nm [85, 86]. Khi cho chất kháng oxy hóa vào dung dịch chứa DPPH, các chất kháng oxy hóa sẽ khử gốc DPPH thành DPPH có màu vàng nhạt, do đó làm giảm độ hấp thu của DPPH [87].

y = 0.3671x + 0.0076 R² = 0.9984

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

Nồng độ FeSO4(mg/L)

Độ hấp thu

Cường độ màu của thuốc thử DPPH tỷ lệ nghịch với nồng độ các chất kháng oxy hóa và thời gian phản ứng, được đo bằng máy quang phổ so màu.

Trong nghiên cứu này, độ hấp thu ban đầu của dung dịch DPPH trong dung môi methanol là 1,1 ± 0,02, thời gian cho phản ứng là 40 phút, đo độ hấp thu tại bước sóng 515 nm [85, 88]. Trolox được sử dụng làm chất chuẩn cho phản ứng này. Hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH được biểu diễn bằng mg đương lượng Trolox/g chất khô nguyên liệu.

Hóa chất

- Cân 0,002g DPPH và định mức lên 100mL bằng methanol. Thêm DPPH sao cho độ hấp thu đạt giá trị 1,1 ± 0,02. Dung dịch được bảo quản trong tủ đông và tránh sáng.

- Cân 0,025g Trolox và định mức lên 100mL bằng etanol 99,5 thu được dung dịch trolox cú nồng độ 1000 àM.

Trình tự tiến hành Dựng đường chuẩn

Pha loãng dung dịch chuẩn Trolox ở nồng độ 1000 μM thành các dung dịch nồng độ 0, 250, 500, 750 μM.

Cho 0,1 mL dung dịch Trolox ở các nồng độ vào ống nghiệm. Tiếp tục cho 3,9 mL dung dịch DPPH đã pha ở trên vào mỗi ống. Lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối 40 phút.

Đo độ hấp thu tại bước sóng 515 nm. Dựng đường chuẩn nồng độ Trolox theo độ hấp thu với nồng độ Trolox (àM). Đường chuẩn xõy dựng được theo Hỡnh 7.7 :

Nồng độ Trolox (μM) 0 250 500 750 1000 AOA 0,000 0,104 0,225 0,346 0,439

Hình 7.7 Đường chuẩn xác định hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH Chuẩn bị mẫu phân tích

Mẫu Blank: thực hiện tương tự nhưng thay bằng dung môi trích ly.

Từ đồ thị đường chuẩn và độ hấp thu của mẫu, ta xác định được hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu phân tích. Kết quả được tính theo đương lượng Trolox (mM TE/g nguyên liệu)

7.2.15 Phương pháp TPA

TPA (Texture profile analysis) là một phương pháp dùng công cụ để xác định cấu trúc của thực phẩm bằng lực nén cơ học. Đây là phương pháp đánh giá được nhiều thuộc tính cấu trúc của thực phẩm trong một lần thử, thiết bị kĩ thuật sử dụng

y = 2227.9x + 3.6235 R² = 0.9981

0 200 400 600 800 1000 1200

0 0.2 0.4 0.6

Nồng độ Trolox (μM)

Độ hấp thu

đường cong của lực, đường cong của sự biến dạng để phân loại các đặc tính cấu trúc then chốt của mẫu, là cầu nối với cảm quan. Phương pháp này chỉ dùng lực nén, mẫu được tiến hành nén 2 lần liên tiếp. Việc thao tác lặp lại nhiều lần giúp ta có thể tính toán được các đặc tính cấu trúc. Kết quả thu được là một đường cong thể hiện quan hệ giữa lực và thời gian (Hình 7.8). Một vài thuộc tính cấu trúc như độ cứng, độ cố kết, độ nhớt, độ đàn hồi có thể được đánh giá từ đường cong này.

Hình 7.8 Giản đồ lực – thời gian trong phép đo TPA Các thông số đo lường bao gồm:

Độ cứng (g) – Hardness

Theo đặc tính vật lý: độ cứng là lực cần thiết để làm mẫu biến dạng đến một mức xác định

cho trước. Theo đặc tính cảm quan: độ cứng là lực cần thiết để cắn đứt mẫu hoàn toàn khi mẫu được đặt giữa các răng hàm. Đối với phương pháp TPA độ cứng được xác định bằng giá trị đỉnh lực cao nhất trong chu kỳ nén đầu tiên.

Độ cố kết – Cohesiveness

Theo đặc tính vật lí: độ cố kết là mức độ vật liệu bị biến dạng trước khi xảy ra nứt vỡ. Theo đặc tính cảm quan: độ cố kết là mức độ biến dạng của mẫu trước khi vỡ ra, khi xuyên qua mẫu hoàn toàn bằng răng hàm. Theo phương pháp TPA độ cố

kết được tính bằng tỷ số phần diện tích dưới chu kỳ nén thứ hai và phần diện tích dưới chu kỳ nén thứ nhất, tức S2/S1.

Độ phục hồi (%) – Springiness

Theo đặc tính vật lí: độ đàn hồi là mức độ vật liệu phục hồi lại trạng thái ban đầu sau khi bị làm biến dạng và thôi tác dụng lực. Theo đặc tính cảm quan: độ đàn hồi là mức độ mẫu có thể hồi phục trở lại hình dạng, kích thước ban đầu sau khi được nén một phần giữa lưỡi và vòm miệng.

Độ dính (g.s) – Adhesiveness

Theo đặc tính vật lí: độ dính là công cần thiết để cắt đứt các liên kết giữa bề mặt mẫu thực phẩm và bề mặt tiếp xúc với mẫu đó. Theo đặc tính cảm quan: độ dính là lực cần thiết để gỡ thực phẩm dính vào miệng (thường là vòm miệng) khi ăn. Độ dính được tính theo diện tích phần âm S3.

Độ nhai (g) – Chewiness:

Theo đặc tính vật lí: độ nhai là tổng năng lượng cần thiết để nhai thực phẩm đến kích thước đủ nhỏ để nuốt được. Theo đặc tính cảm quan: độ nhai là thời gian (giây) cần thiết để nghiền mẫu, khi có một lực không đổi tác dụng, đến khi thực phẩm đủ nhỏ để có thể nuốt. Độ nhai được tính bằng tích của độ cứng, độ cố kết và độ đàn hồi.

Độ dai (g) – Gumminess:

Theo đặc tính vật lí: độ dai là năng lượng cần thiết để nghiền vụn thực phẩm đến kích thước đủ nhỏ để nuốt được. Trong đó thực phẩm phải có độ cứng thấp, độ cố kết cao. Theo đặc tính cảm quan: độ dai là mức độ các tiểu phần dính lại với nhau trong suốt quá trình nhai, năng lượng cần thiết để nghiền vụn thực phẩm đủ nhỏ để có thể nuốt. Độ dai được tính bằng độ cứng nhân độ cố kết.

Thiết bị sử dụng để đo TPA là thiết bị đo cấu trúc model TA.XTplusC của hãng Stable Micro System, Anh. Đầu đo sử dụng là đầu đo PT3.

Bảng 7.1 Tỷ lệ Am/Ap của hỗn hợp bột gạo lứt và 5 loại tinh bột

Gạo lứt Khoai mì

Khoai

tây Bắp Dong

Riềng Đậu xanh Khối lượng huyền phù

bột gạo (g) 1000 1000 1000 1000 1000 1000

Độ ẩm (%) 60 60 60 60 60 60

Khối lượng chất khô (g) 400 400 400 400 400 400

Protein (g) 32,8 32,8 32,8 32,8 32,8 32,8

Khối lượng Am trong

gạo (g) 42,49 42,49 42,49 42,49 42,49 42,49

Khối lượng tinh bột

trong gạo (g) 312,4 312,4 312,4 312,4 312,4 312,4 Khối lượng tinh bột thêm

vào (g) 0 580 460 192 160 98

% Amylose tinh bột 13,6 25,8 28,1 35 37 49,7

Tổng khối lượng tinh bột

(g) 312,4 892,4 772,4 504,4 472,4 410,4

Tổng khối lượng chất

khô (g) 400 980 860 592 560 498

Khối lượng Am t tinh

bột (g) 0,0 149,6 129,3 67,2 59,2 48,7

Am tổng (theo TB) 42,5 192,1 171,7 109,7 101,7 91,2 Am (% tinh bột tổng) 13,6 21,5 22,2 21,7 21,5 22,2 Khôi lượng Ap tổng (g) 269,9 700,3 600,7 394,7 370,7 319,2

Tỷ lệ Am/Ap 15,74 27,44 28,59 27,79 27,43 28,57

Protein (% chất khô) 8,2 3,3 3,8 5,5 5,9 6,6

Tinh bột (% chất khô

tổng) 78,1 91,1 89,8 85,2 84,4 82,4

Bảng 7.2 Tỷ lệ Am/Ap của hỗn hợp bột gạo lứt và tinh bột đậu xanh

Tỷ lệ bổ sung 0% đậu

xanh

15% đậu xanh

30% đậu xanh

45% đậu xanh

Khối lượng huyền phù bột gạo (g) 1000 1000 1000 1000

Độ ẩm (%) 60 60 60 60

Khối lượng chất khô (g) 400 400 400 400

Protein (g) 32,8 32,8 32,8 32,8

Khối lượng Am trong gạo (g) 42,49 42,49 42,49 42,49 Khối lượng tinh bột trong gạo (g) 312,4 312,4 312,4 312,4

Khối lượng tinh bột thêm vào (g) 0 60 120 180

% Amylose tinh bột 49,7 49,7 49,7 49,7

Tổng khối lượng tinh bột (g) 312,4 372,4 432,4 492,4

Tổng khối lượng chất khô (g) 400 460 520 580

Khối lượng Amylose tinh bột

(theo TB) 0,0 29,8 59,6 89,5

Khối lượng Am tổng (g) 42,49 72,31 102,13 131,95

Tỷ lệ Am % tinh bột tổng 13,6 19,4 23,6 26,8

Khối lượng Ap tổng (g) 269,9 300,1 330,3 360,5

Tỷ lệ Am/Ap 15,74 24,09 30,92 36,61

Protein (% chất khô) 8,2 7,1 6,3 5,7

Tinh bột (% chất khô tổng) 78,1 81,0 83,2 84,9

Đánh giá tính chất nguyên liệu bột

Xác định hàm lượng amylose