3.2. Đánh giá khả năng tương thích sinh học của vật liệu
3.2.1.1. Nghiên cứu sự hình thành màng apatit trong thử nghiệm in-vitro
Các mẫu titan phủ HA và FHA được sử dụng để nghiên cứu khả năng tương thích sinh học của vật liệu trong môi trường dịch giả cơ thể người SBF trong điều kiện nhiệt độ 37 oC và pH khoảng 7,2. Các mẫu titan phủ HA và FHA có kích thước ϕ15 mm x 2 mm được ngâm trong 200 mL dung dịch SBF có thành phần như trên bảng 2.3 trong lọ thủy tinh có nắp đậy và được giữ nhiệt độ ổn định bằng bình ổn nhiệt. Giá trị pH của dung dịch SBF được theo dõi liên tục theo thời gian ngâm mẫu đến khi kết thúc thử nghiệm. Tại mỗi lần đo pH, dung dịch SBF được lấy từ lọ thủy tinh ngâm mẫu titan phủ HA và FHA với thể tích là 2 mL. Kết quả được chỉ ra trên đồ thị hình 3.37.
Trong cả hai thử nghiệm cho mẫu HA/Ti và FHA/Ti, pH ở thời điểm trước khi ngâm (t = 0) là 7,2. Trong 3 ngày đầu ngâm mẫu, khi tăng thời gian ngâm pH của dung dịch SBF tăng lên rất nhanh đến giá trị 7,8. Sau đó, pH vẫn tăng nhưng tăng chậm và giá trị pH cao nhất đạt được là pH = 8,0 tại thời gian ngâm 17 ngày. Sau 21 ngày ngâm mẫu trong SBF thì pH dung dịch có dấu hiệu giảm nhẹ. Sự tăng nhanh
93 giá trị pH của dung dịch sau khi ngâm mẫu HA trong thời gian đầu có thể là do sự sinh ra nhóm OH- trên bề mặt mẫu theo chiều thuận của phản ứng hòa tan lớp phủ sau:
Ca10(PO4)6(OH)2 → 10Ca2+ +6 PO43- +2 OH- (3.11)
Hình 3.37. Sự biến đổi pH của dung dịch SBF theo thời gian ngâm mẫu
Sau đó, quá trình này chậm lại do trên bề mặt mẫu có sự hấp phụ các ion Na+, K+, Mg2+ , Cl-, CO32-, SO42-, H2PO4- ...làm cản trở quá trình hòa tan lớp phủ. Đồng thời sự có mặt của các ion Ca2+, PO43-, OH- có thể tạo ra lớp màng apatit theo chiều nghịch của phản ứng (3.1). Lúc này, trong dung dịch SBF ở bề mặt mẫu xảy ra đồng thời hai quá trình phản ứng là phản ứng hòa tan lớp phủ và phản ứng tạo ra màng apatit mới với các tốc độ khác nhau. Khi quá trình hòa tan màng apatit chiếm ưu thế hơn, pH của dung dịch SBF tăng lên. Giá trị pH đạt cao nhất trong khoảng thời gian ngâm mẫu là 17 ngày thể hiện quá trình hòa tan và tái tạo màng HA đã đạt tới cân bằng. Tuy nhiên, sau đó pH của dung dịch lại giảm nhẹ, điều này là do sự dịch chuyển cân bằng về phía chiều nghịch do sự hình thành lớp màng apatit nên đã tiêu thụ một lượng OH- và làm cho pH giảm đi.
94 Đối với mẫu titan phủ FHA, trong 3 ngày đầu ngâm mẫu pH cũng tăng nhanh do phản ứng hòa tan lớp FHA như sau:
Ca10(PO4)6(OH)F → 10Ca2+ + 6PO43- + OH- + F- (3.12)
Trong thời gian ngâm tiếp theo đến khi kết thúc thử nghiệm vitro, pH của dung dịch ngâm mẫu FHA cũng tăng chậm lại tương tự như lớp phủ HA.
Như vậy, trong thử nghiệm in-vitro, các quá trình hòa tan lớp phủ, hấp phụ ion và hiện tượng kết tinh trở lại diễn ra xen kẽ nhau trên bề mặt mẫu. Đó là một quá trình hóa lí phức tạp xảy ra liên tục, dẫn đến sự hình thành kết tinh mới hoặc hòa tan của lớp phủ. Kết quả là pH của dung dịch SBF thay đổi liên tục trong suốt thời gian thử nghiệm.
Để đánh giá ảnh hưởng của thử nghiệm in-vitro đến các quá trình lý hóa xảy ra trên vật liệu titan phủ HA và FHA và cơ chế của sự hình thành màng apatit trong thử nghiệm in-vitro, các mẫu đã được tiến hành đo phổ tổng trở Nyquits theo thời gian ngâm trong dung dịch SBF với các mốc thời gian 1 giờ, 1 ngày, 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày và 21 ngày. Các phổ tổng trở được chỉ ra trên các hình 3.38 và 3.39.
Hình 3.38. Phổ tổng trở Nyquits của vật liệu phủ HA trong dung dịch SBF theo thời gian.
Nhìn chung, phổ tổng trở Nyquits của các mẫu theo thời gian ngâm đều có dạng 2 cung bán nguyệt chưa hoàn chỉnh. Trong đó, một cung bán nguyệt thứ nhất
95 với đường kính nhỏ và một cung bán nguyệt thứ 2 có đường kính tăng theo thời gian ngâm mẫu. Đối với lớp phủ HA, đường kính của cung bán nguyệt thứ nhất khoảng 2.103 (Ω) và không thay đổi nhiều theo thời gian ngâm mẫu. Trong khi đường kính của cung bán nguyệt thứ hai tăng lên đáng kể theo thời gian ngâm. Điều này là do sự kết tinh của lớp apatit đã làm cho diện tích bề mặt giảm đi. Mặt khác các tinh thể mới được hình thành sẽ đi sâu vào bề mặt nền kim loại qua các vi nứt giúp bảo vệ che chắn cho nền kim loại do đó làm tăng điện trở chuyển điện tích. Vì vậy đường kính của cung thứ 2 tăng lên rõ rệt ở thời điểm 14 đến 21 ngày ngâm mẫu.
Hình 3.39. Phổ tổng trở Nyquits vật liệu phủ FHA trong dung dịch SBF theo thời gian Đối với lớp phủ FHA, đường kính của cung thứ nhất dao động khoảng 3.103(Ω) - 4.103 (Ω). Điều này có thể do lớp FHA chắc đặc hơn lớp HA và do đó cung bán nguyệt thứ nhất của FHA cao hơn so với HA. Cung bán nguyệt thứ 2 của mẫu FHA cũng có đường kính tăng theo thời gian ngâm mẫu như thể hiện trên hình 3.39. Như vậy, sau 21 ngày ngâm mẫu trong dung dịch SBF, trong cả hai trường hợp HA và FHA đã có sự hình thành màng apatit mới trên bề mặt mẫu.
Để so sánh khả năng tương thích sinh học của titan phủ HA và titan phủ FHA, tiến hành phân tích phổ tổng trở của chúng ở các thời điểm: ngày đầu tiên ngâm mẫu
96 và ngày kết thúc quá trình thử nghiệm và các kết quả được thể hiện trên hình 3.40 và 3.41.
Hình 3.40. Phổ tổng trở của mẫu sau 1 ngày ngâm trong dung dịch SBF
Hình 3.41. Phổ tổng trở của mẫu sau 21 ngày ngâm trong dung dịch SBF
Trong ngày đầu tiên, đồ thị có dạng 2 cung bán nguyệt, trong đó đường kính của cả 2 cung bán nguyệt của mẫu FHA lớn hơn so với HA. Điều này thể hiện rằng ban đầu mẫu FHA có khả năng chống ăn mòn tốt hơn so với mẫu HA. Tuy nhiên, khi
97 tăng thời gian ngâm mẫu đến 21 ngày (hình 3.41), mặc dù đường kính của cung bán nguyệt nhỏ không thay đổi nhiều trong cả hai trường hợp, cung thứ 2 của mẫu HA lại có bán kính lớn hơn so với FHA. Điều này có thể giải thích là do sự kết tinh tạo thành lớp apatit mới trên mẫu phủ HA diễn ra mạnh mẽ hơn so với FHA và chúng đã tạo ra màng chắn giúp bảo vệ nền kim loại.
Từ các kết quả đo phổ tổng trở chúng tôi đề xuất một mô hình mạch tương đương cho phổ tổng trở của lớp phủ HA/Ti và FHA/Ti như trong hình 3.42. Phổ tổng trở thể hiện 2 vòng bán nguyệt tương ứng ở tần số cao là mạch song song của điện dung của lớp phủ HA hoặc FHA (C) và điện trở lớp xốp (Rpo) và ở tần số thấp hơn tương ứng với điện trở chuyển điện tích (Rct) và điện dung lớp kép (Cdl). Trong khi Rs là điện trở của dung dịch. Mô hình này cũng phù hợp mô hình đã đưa ra trong nghiên cứu của tác giả Wijesinghe [117].
Hình 3.42. Sơ đồ mạch tương đương
Sự hình thành lớp apatit mới trên bề mặt lớp phủ theo thời gian ngâm mẫu được xác nhận bằng ảnh SEM như thể hiện trên hình 3.43. Sau 7 ngày ngâm mẫu, trên bề mặt lớp phủ xuất hiện những đốm trắng nhỏ li ti có kích thước cỡ nano khá đồng đều với mật độ hạt thấp. Mật độ và kích thước của các hạt kết tinh trên bề mặt lớp phủ tăng lên với thời gian ngâm đến 14 ngày. Đến 21 ngày, một cấu trúc bao gồm những hạt nhỏ li ti dày đặc được kết tinh trên bề mặt lớp phủ.
98 Hình 3.43. Ảnh SEM các của các HA mẫu trước và sau khi thử nghiệm in-vitro
Hình 3.44. Ảnh SEM các của các mẫu sau khi thử nghiệm in-vitro 21 ngày.
Những chấm trắng nhỏ được hình thành là kết quả của các quá trình hòa tan một phần lớp phủ, sự hấp phụ của các ion trong dung dịch SBF và quá trình tái kết tinh trở lại của các tinh HA lên bề mặt lớp phủ. Trên hình 3.44 là hình ảnh bề mặt của mẫu HA và FHA sau 21 ngày thử nghiệm vitro. Chúng ta dễ dàng quan sát thấy trên bề mặt mẫu HA, mật độ và kích thước hạt kết tinh cao hơn so với mẫu FHA.
99 Cơ chế của sự hình thành các tinh thể HA lên bề mặt lớp phủ trong dung dịch SBF được giải thích theo các giai đoạn như chỉ ra trên hình 3.45. Đầu tiên, khi bắt đầu ngâm mẫu, các ion trong dung dịch SBF hấp phụ lên bề mặt mẫu đồng thời có sự phá hủy ở vị trí các biên hạt như diễn ra ở giai đoạn 1. Sau đó quá trình lớp phủ HA hòa tan tiếp tục xảy ra (giai đoạn 2). Ở giai đoạn tiếp theo, các ion trong dung dịch SBF hấp phụ trên bề mặt mẫu, đồng thời sự có mặt của Ca2+ và PO43- sẽ tham gia phản ứng để tạo ra Ca3(PO4)2 và sau cùng là phản ứng tạo ra HA với sự có mặt của ion OH- trong dung dịch SBF. Lúc này xảy ra sự kết tinh tạo trở lại của các tinh thể HA xảy ra trong giai đoạn (3). Các quá trình hòa tan, hấp phụ và kết tinh trở lại diễn ra liên tục và đan xen lẫn nhau [118]. Kết quả là hình thành nên vô số các hạt li ti màu trắng trên bề mặt lớp phủ sau khi thử nghiệm vitro.
Hình 3.45. Sơ đồ các quá trình phản ứng trong thử nghiệm vitro
Để xác minh những hạt kết tủa đó là HA chúng tôi tiến hành phân tích thành phần hóa học của chúng bằng phương pháp EDS tại các điểm kết tinh (hình 3.46) và tại vùng điểm kết tinh (hình 3.47), kết quả chỉ ra trên bảng 3.8 và bảng 3.9. Từ kết quả phân tích EDS trên bảng 3.8 của mẫu tại điểm kết tinh cho thấy các chấm trắng nhỏ li ti có thành phần bao gồm 3 nguyên tố là Ca, P và O trong đó tỉ lệ của Ca/P là 1,51. Như vậy các hạt nhỏ li ti này là các tinh thể HA mọc lên trên bề mặt mẫu khi ngâm trong dung dịch SBF. Tỷ lệ Ca/P khi phân tích tại vùng kết tinh trên bề mặt
100 mẫu cũng cho kết quả tương tự như chỉ ra trên bảng 3.9. Sự có mặt của các nguyên tố khác như Na, Cl là do sự hấp phụ các ion trong dung dịch SBF lên bề mặt mẫu.
Hình 3.46. Phân tích EDS tại điểm trên bề mặt mẫu sau thử nghiệm Bảng 3.8. Thành phần hóa học tại một điểm kết tinh sau thử nghiệm vitro
Nguyên tố % khối lượng % nguyên tố
O 48,07 67,49
P 20,66 14,98
Ca 31,27 17,52
Hình 3.47. Phân tích EDS tại vùng trên bề mặt mẫu sau thử nghiệm
Bảng 3.9. Thành phần hóa học tại vùng hạt kết tinh của mẫu sau thử nghiệm vitro Nguyên tố % khối lượng % nguyên tố
O 39,37 57,86
Na 5,17 5,29
Mg 1,83 1,77
P 18,19 13,81
Cl 6,22 4,13
Ca 29,21 17,14