2.2.1. Mẫu vật nghiên cứu
- Bộ gan, mật trâu, bò (tìm sán lá gan lớn trƣởng thành).
- Mẫu phân trâu, bò (xác định tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm sán lá gan lớn). - Mẫu ốc nƣớc ngọt sống ở các ao gần khu vực chuồng trâu, bò, ở trên bãi chăn trâu, bò (ao, kênh, mƣơng).
2.2.2. Dụng cụ và hoá chất
- Kính hiển vi quang học, kính lúp.
- Dụng cụ xét nghiệm mẫu: cốc thuỷ tinh, hộp lồng, lam kính, la men, lƣới lọc phân và các dụng cụ thí nghiệm khác.
- Thuốc điều trị bệnh sán lá gan lớn
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3.1. Điều tra về điều kiện tự nhiên, xã hộ và tình hình phát triển chăn nuôi trâu, bò ở tỉnh Quảng Ninh trong 5 năm gần đây trâu, bò ở tỉnh Quảng Ninh trong 5 năm gần đây
2.3.1.1. Điều kiện tự nhiên
- Phân chia các huyện, thành phố tại các địa điểm nghiên cứu của tỉnh Quảng Ninh theo vùng sinh thái chăn nuôi
2.3.1.2. Tình hình phát triển chăn nuôi trâu, bò ở tỉnh Quảng Ninh
2.3.2. Điều tra các yếu tố ảnh hƣởng đến sự lƣu tồn và phát triển của Fasciola
spp. ở các địa điểm nghiên cứu.
2.3.2.1. Các yếu tố xã hội
- Phƣơng thức chăn nuôi trâu, bò tại các địa điểm nghiên cứu
- Tình hình sử dụng bãi chăn thả trâu, bò ở các địa điểm nghiên cứu
- Hiện trạng vệ sinh chăn nuôi thú y đối với trâu, bò tại các địa điểm nghiên cứu - Hiện trạng xử lý và sử dụng phân trâu, bò
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.2.2. Các yếu tố tự nhiên
2.3.3. Nghiên cứu tình nhiễm sán lá gan lớn trâu bò ở 4 huyện, thành của tỉnh Quảng Ninh
- Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm sán lá gan lởn trâu bò (Qua mổ khám)
2.3.4. Tỷ lệ, cƣờng độ nhiễm sán la gan lớn ở 4 huyện, thành tỉnh Quảng Ninh
(Qua xét nghiệm phân)
2.3.4.1. Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan lớn ở trâu, bò theo tuổi 2.3.4.2. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bò theo vùng.
2.3.4.3. Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan lớn theo phương thức chăn nuôi 2.3.4.4 Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan lớn theo mùa vụ
2.3.5. Nghiên cứu vật chủ trung gian của sán lá Fasciola spp.
2.3.5.1. Thành phần loài của 2 loài ốc giống Limnaea
2.3.5.2. Kết quả xét nghiệm ốc Limnaea tìm ấu trùng sán lá gan lớn
2.3.5. Nghiên cứu các biện pháp phòng, trừ
2.3.5.1. Thử nghiệm xác định hiệu lực của một số thuốc tẩy sán lá gan cho trâu, bò 2.3.5.2. Xác định độ an toàn của thuốc tẩy sán lá gan cho trâu, bò 2.3.5.2. Xác định độ an toàn của thuốc tẩy sán lá gan cho trâu, bò 2.3.5.2. Xác định độ an toàn của thuốc tẩy sán lá gan cho trâu, bò
2.3.5.3. Đề xuất biện pháp phòng trị sán lá gan lớn cho trâu, bò
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Điều tra về điều kiện tự nhiên, xã hộ và tình hình phát triển chăn nuôi trâu, bò ở tỉnh Quảng Ninh trong 5 năm gần đây trâu, bò ở tỉnh Quảng Ninh trong 5 năm gần đây
2.4.1.1. Điều kiện tự nhiên
Sử dụng niên giám thống kê của chi cuc thống kê tỉnh Quảng ninh và số liệu của trung tâm dự báo khí tƣợng thủy văn.
2.4.1.2. Tình hình phát triển chăn nuôi trâu, bò của tỉnh Quảng Ninh năm 2006-2010
- Sử dụng các niên giám thống kê của tỉnh trong 5 năm gần đây của Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Chi cục Thống kê tỉnh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.4.2. Điều tra các yếu tố ảnh hƣởng đến sự lƣu tồn và phát triển của Fasciola spp. ở các địa điểm nghiên cứu spp. ở các địa điểm nghiên cứu
2.4.2.1. Các yếu tố xã hội
- Phƣơng thức chăn nuôi, trồng trọt, tập quán, vệ sinh thú ý, vệ sinh chăn nuôi. Chúng tôi tiến hành điều tra phỏng vấn theo bộ câu hỏi tới từng hộ chăn nuôi trâu, bò tại các địa điểm nghiên cứu.
- Xây dựng mẫu phiếu điều tra.
+ Phƣơng thức chăn nuôi trâu, bò tại các địa điểm nghiên cứu
+ Tình hình sử dụng bãi chăn thả trâu, bò ở các địa điểm nghiên cứu
+ Hiện trạng vệ sinh chăn nuôi thú y đối với trâu, bò tại các địa điểm nghiên cứu + Hiện trạng xử lý và sử dụng phân trâu, bò
+ Tẩy sán lá gan lớn định kỳ
- Đối tƣợng điều tra là các hộ chăn nuôi trâu, bò tại các địa điểm nghiên cứu.
2.4.2.2. Các yếu tố tự nhiên
- Sử dụng niên giám thống kê của chi cuc thống kê tỉnh Quảng ninh và số liệu của trung tâm dự báo khí tƣợng thủy văn.
- Yếu tố nhiệt độ, lƣợng mƣa, địa hình, đặc điểm thủy vực ảnh hƣởng đến sự tồn tại và phát triển của ốc Limnae
- Yếu tố nhiệt độ, lƣợng mƣa, địa hình, đặc điểm thủy vực ảnh hƣởng đến sự phát triển của thực vật thủy sinh.
2.4.3. Nghiên cứu tình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bò ở 4 huyện, thành của tỉnh Quảng Ninh. (Qua mổ khám) Quảng Ninh. (Qua mổ khám)
2.4.3.1. Phương pháp thu thập mẫu sán lá gan lớn trưởng thành
Phƣơng pháp mổ khám không toàn diện (xét nghiệm gan, mật): Là phƣơng pháp mổ khám để phát hiện sán lá gan lớn trƣởng thành ở gan, mật trong cơ thể trâu, bò. Mục đích biết tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm sán tại các địa điểm nghiên cứu ở Quảng Ninh.
Khi phát hiện đƣợc sán lá gan ta dùng bút lông hay panh nhẹ nhàng tách sán lá gan rồi để chúng chết tự nhiên trong dung dịch muối sinh lý 0,8%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.4.3.2. Phương pháp xử lý và bảo quản tạm thời mẫu sán lá gan lớn
Mẫu sán lá trƣởng thành thu đƣợc, sau khi chết đƣợc bảo quản trong cồn 70°. Tất cả đƣợc ghi chép rõ ràng và đầy đủ bao gồm: Loài gia súc, tuổi, số lƣợng sán lá gan, địa điểm và ngày, tháng mổ khám. Mẫu đƣợc đựng trong các lọ nút nhám 50 ml hoặc 100 ml. Trƣờng hợp số lƣợng mẫu sán lá gan lớn nhiều (trên 20 mẫu) thì phải thay cồn liên tục 2 - 3 lần, mỗi lần cách nhau 3 - 4 ngày (để đảm bảo độ cồn bảo quản vẫn đạt 70°).
2.4.3.3. Phương pháp làm tiêu bản cố định sán lá gan lớn
Nhuộm Carmin:
Chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm Carmin-axít clohidric (HCL): lấy 5g Carmin nghiền nhỏ cho vào bình tam giác chứa 5ml HCL và 5ml nƣớc cất, để yên sau 1 giờ, sau đó cho thêm 200ml cồn 90ºC, lắc đều, đậy nút bông, đun cách thủy cho đến khi Carmin tan hết, để 1 ngày sau lọc. Dung dịch để sau 1 tuần mới dùng.
Nhuộm mẫu: nhuộm mẫu trong Carmin axít. Tùy thuộc và độ lớn của mẫu mà thời gian mẫu để trong dung dịch nhuộm có thể từ 5 phút đến 1 giời. Để tẩy bớt mầm Carmin, làm rõ cấu tạo chi tiết , mẫu phải chuyển sang cồn - axít (100ml còn 80º, thêm vào 2 - 3 giọt HCL) với thời gian 1 đến 10 phút tùy thuộc vào độ lớn của mẫu. Sau đó rút nƣớc trong cồn ở các nồng độ khác nhau: 80º, 90º, 100º, thời gian cho mỗi loại cồn là 5 - 7 phút hoặc lâu hơn tùy thuộc vào kích thƣớc, độ dầy của mẫu. Mẫu có kích thƣớc lớn thƣờng để trong dung dịch lâu hơn. Sau đó là trong mẫu bằng dung dịch xylen + cồn 100º theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian từ 1 - 2 phút. Cuối cùng lên tiêu bản bằng cách nhỏ 1-2 giọt bom Canada lên lam kính, sau đó gắp sán ở đĩa xylem đặt ngay ngắn, nhỏ tiếp một dọt bom lên rồi đậy lamen lại. Để tiêu bản ở vị trí nằm cho tới khi bom trở nên khô thì tiêu bản đã hoàn toàn đảm bảo.
2.4.3.4. Định loại loài sán lá gây bệnh Fasciolasis ở trâu, bò
Để đánh giá một cách đầy đủ hơn thành phần loài của sán lá gan lớn gây bệnh, chúng tôi tiến hành mổ khám trâu bò tại các lò mổ ở các địa điểm nghiên cứu. Sau khi thu đƣợc mẫu sán chúng tôi làm tiêu bản cố định, đo, vẽ dƣới kính hiểm vi thông thƣờng, định loại sán lá gan lớn theo hình thái dựa vào tài liệu của Nguyễn Thị Lê, Phan Văn Lực, Hà Duy Ngọ, Nguyễn Văn Đức, Nguyễn Thị Minh (1996) [20]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Tình hình nhiễm chung sán lá gan lớn ở trâu, bò tỉnh Quảng Ninh
- Xác định tỉ lệ và cƣờng độ nhiễm sán lá gan lớn thông qua số lƣợng cá thể sán lá gan lớn thu đƣợc ở các bộ gan, mật của trâu, bò mổ khám tại các lò mổ ở các địa điểm nghiên cứu.
2.4.4. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu, bò một số huyện, thị thuộc tỉnh Quảng Ninh (Qua xét nghiệm phân) Quảng Ninh (Qua xét nghiệm phân)
2.4.4.1. Phương pháp lấy mẫu phân
Lấy ngẫu nhiên phân trâu, bò nuôi ở nông hộ và gia đình theo phƣơng pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc. Lấy phân trực tiếp từ trực tràng trâu, bò. Để riêng mỗi mẫu phân vào một túi nilon nhỏ, mỗi túi đều có nhãn ghi: loại gia súc (trâu, bò), tuổi, địa điểm, trạng thái phân, thời gian lấy mẫu và các biểu hiện lâm sàng của trâu, bò (nếu có).
2.4.4.2. Phương pháp xét nghiệm phân
Lấy khoảng 5 gram phân trâu, bò, cho vào cốc, cho một ít nƣớc lã sạch vào, khuấy đều cho tan phân, sau đó cho thêm gấp 5 - 10 lần nƣớc. Khuấy đều, lọc qua lƣới lọc (mắt lƣới có đƣờng kính 0,5 - 1 mm) vào cốc khác. Bỏ cặn bã. Đổ thêm nƣớc cho đầy cốc, khuấy đều rồi để lắng cặn từ 15 - 20 phút, cẩn thận gạn nƣớc trên đi lấy cặn, cho thêm nƣớc vào đầy cốc để lắng. Lặp đi lặp lại nhiều lần cho đến khi nƣớc trong, gạn phần nƣớc trong phía trên, lấy cặn đáy cho vào đĩa petri hoặc đĩa kính đồng hồ, quan sát dƣới kính lúp hoặc kính hiển vi để tìm trứng sán lá gan.
2.4.4.3. Phương pháp xác định cường độ nhiễm
Theo Nguyễn Thị Kim Lan (1999) [13], cƣờng độ nhiễm (hay mức độ nhiễm) sán lá gan lớn qua xét nghiệm phân đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đếm trứng sán lá gan lớn trên một vi trƣờng kính hiểm vi, quy định nhƣ sau:
1 - 3 trứng/ vi trƣờng là nhiễm nhẹ (ký hiệu +) 4 - 6 trứng/ vi trƣờng là nhiễm trung bình (ký hiệu + +) 7 - 9 trứng/ vi trƣờng là nhiễm nặng (ký hiệu + + +) Trên 9 trứng/ vi trƣờng là nhiễm rất nặng (ký hiệu + + + +)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Cƣờng độ nhiễm sán lá gan lớn qua mổ khám đƣợc xác định bằng cách đếm số lƣợng sán lá gan lớn ký sinh ở mỗi trâu bò trong quá trình mổ khám và định loại.
+ Tình hình nhiễm sán lá gan lớn theo mùa vụ:
Mùa vụ trong năm đƣợc theo dõi gồm:
- Vụ Đông - Xuân : từ tháng 10 - tháng 3 năm sau - Vụ Hè - Thu : từ tháng 4 - tháng 9
+ Tình hình nhiễm sán lá gan lớn theo vùng sinh thái:
Nghiên cứu tình hình nhiễm giun sán đƣờng tiêu hóa ở trâu bò qua xét nghiệm phân. Nội dung nghiên cứu tại huyện Đông Triều, thàng phố Uông Bí, huyện Yên Hƣng, huyện Hoàng Bồ thuộc 2 vùng sinh thái:
Vùng I: Là vùng có bãi cỏ rộng, không có hoặc rất ít ao, ruộng, mƣơng ngòi, suối nhỏ. Thành phố Uông Bí, huyện Hoành Bồ thuộc vùng sinh thái này.
Vùng II: Có nhiều ruộng nƣớc, ao, mƣơng, ngòi và khe, suối nhỏ. Huyện Đông Triều và Yên Hƣng thuộc vùng sinh thái này.
2.4.5. Nghiên cứu tình hình nhiễm ấu trùng sán lá gan lớn ở ốc Limnaea
2.4.5.1. Phương pháp lấy mẫu
Bắt ốc bằng tay ở ruộng lúa, các khe nƣớc nhỏ, vũng nƣớc nhỏ ở vùng hay chăn thả trâu, bò. Ốc thu đƣợc để trong túi nilon, có nhãn ghi địa điểm và thời gian thu thập mẫu rồi chuyển về Phòng thí nghiệm của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật để xét nghiệm.
2.4.5.2. Phương pháp định loại ốc
Phân loại ốc theo phƣơng pháp phân loại hình thái của Đặng Ngọc Thanh, Thái Trần Bái, Phạm Văn Miên (1980) [32].
2.4.5.3. Phương pháp ép ốc xét nghiệm mẫu: (Áp dụng cho ốc nhỏ, vỏ mỏng)
Sử dụng hai lam kính sạch có kích thƣớc 10 x 3,5cm. Đặt ốc vào giữa 2 lam kính, dùng tay ép nhẹ đến khi vỏ ốc vỡ và óc nát ra. Cuối cùng đƣa lam kính kiểm tra dƣới kính hiểm vi để phát hiện các dạng ấu trùng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.4.5.4. Phương pháp định loại ấu trùng sán
Sau khi phát hiện ấu trùng sán lá trong ốc, dùng pipet hút ra làm tiêu bản tạm thời, sau đó đo vẽ, chụp ảnh dƣới kính hiểm vi để định loại. So sánh hình thái, kích thƣớc các ấu trùng thu đƣợc định loại chúng theo tài liệu của Phạm Ngọc Doanh và Nguyễn Thị Lê (2005) [2].
2.4.6. Biện pháp phòng và trị SLGL cho trâu, bò
Sau khi xét nghiệm phân, phát hiện đƣợc những trâu, bò bị nhiễm sán lá gan lớn, chúng tôi sử dụng thuốc Dertil B, Fasciolide, Dovenix để tẩy sán cho trâu, bò. Xác định khối lƣợng để tính liều thuốc dùng cho trâu, bò.
* Phƣơng pháp xác định trọng lƣợng trâu, bò.
Chúng tôi tiến hành xác định trọng lƣợng trâu, bò áp dụng theo công thức tính trọng lƣợng của Nguyễn Văn Thiện (Viện Chăn Nuôi, 1974).
Đối với trâu: P = 88,4 x VN² x DTC
Đối với Bò: P = 90,0 x VN² x DTC Trong đó: - P: trọng lƣợng trâu, bò (kg).
- VN² : Vòng ngực bình phƣơng (đo chu vi vòng ngực theo phƣơng thẳng đứng ở sau xƣơng bả vai) (m).
- DTC: dài thân chéo (Đo từ điểm trƣớc của khớp bả vai đến điểm cuối cùng của u ngồi) (m).
Công thức cho phép sai số 5%.
Để đánh giá độ an toàn và hiệu lực của thuốc tẩy chúng tôi tiến hành nhƣ sau: * Trƣớc khi tẩy:
- Chúng tôi tiến hành để xác định tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm sán lá gan Fasciola spp. của trâu, bò.
- Chọn 15 con trâu và 15 con bò nhiễm sán lá gan Fasciola spp.
- Kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý: nhịp tim, nhịp thở, thân nhiệt, trạng thái phân, chỉ tiến hành thử nghiệm với những trâu, bò có chỉ tiêu sinh lý bình thƣờng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Sau khi tẩy:
- Sau khi tẩy 6 giờ tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý: nhịp tim, nhịp thở, thân nhiệt và trạng thái phân.
- Sau 24 giờ, tiến hành kiểm tra tìm xác sán thải theo phân.
- Sau khi tẩy 15 ngày, bằng phƣơng pháp xét nghiệm lại phân trâu, bò tìm trứng sán để đánh giá hiệu lực của thuốc tẩy.
* Để đánh giá độ an toàn của thuốc, chúng tôi xác định một số chỉ tiêu sinh lý trƣớc và sau khi dùng thuốc 1 giờ (Theo Cao Văn và cs, 2003 [42]).
2.4.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê sinh học của Nguyễn Văn Thiện (2008) [35] và sử dụng phần mềm Excel trong tính toán số liệu.
Các tham số thống kê gồm: - Số trung bình : n Σx n X ... X X X 1 2 n
Trong đó: X1, X2... + Xn: Các giá trị của biến số n: Dung lƣợng mẫu - Độ lệch tiêu chuẩn: 1 n ) X - Σ(X S 2 x
- Sai số của số trung bình mx= Sx x100
X
Trong đó: mx : Sai số trung bình mẫu Sx : Độ lệch tiêu chuẩn n : Dung lƣợng mẫu
- So sánh mức độ sai khác giữa các số trung bình:
Đối với các tính trạng định lƣợng nhƣ số lƣợng trứng và ấu trùng sán Fasciola, các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
- Bƣớc 1: Tính tTN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 1 2 1 2 2 2 2 1 1 2 1 TN n 1 n 1 . 2 n n 1)S (n 1).S (n X X t Trong đó: X1 và X2 : Trung bình của nhóm 1 và nhóm 2