Cấu trúc và đặc tính của lumbrokinase

1.3. KHÁI QUÁT VỀ ENZYME LUMBROKINASE

1.3.1. Cấu trúc và đặc tính của lumbrokinase

Lumbrokinase là tên gọi chung chỉ một nhóm gồm 6 isozyme có tác dụng thủy ph n fibrin, làm tan cục máu đông. Khối lƣợng ph n tử trung bình của lumbrokinase từ 25 đến 32 kDa [46]. Lumbrokinase là nh ng chuỗi polypeptide đơn giàu asparagine hoặc aspartic acid, rất ít proline và lysin, không chứa thành phần đường. Chúng được xếp vào serine protease kiềm giống trypsin. Tuy nhiên chúng giàu asparagine và aspartic acid hơn so với các serine protease khác đã biết.

Lumbrokinase đƣợc tìm thấy trong ruột, dịch mô và dịch ruột của rất nhiều loài giun đất. Chúng có tác dụng tiêu sợi huyết mạnh, người ta giải thích sự có mặt của nó trong các loại giun là do chúng cần để tiêu hóa thức ăn là nh ng mảnh vụn thực vật và các chất h u cơ trong đất nên chúng sản xuất LK nhƣ một serine protease [46].

Một số nghiên cứu gần đ y cho rằng các enzyme thủy ph n fibrin có thể hòa tan cục máu đông và hạn chế đƣợc khả năng vón cục [19,35]. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều đi vào tách chiết, tinh sạch, đánh giá tính chất l hóa và ứng dụng l m sàng của enzyme thủy ph n fibrin từ giun đất L. rubellus, L. bimastus, E.

Vũ Thị Bích Ngọc 13 Cao học K20 fetida hoặc E. Andrei [28,66,67]. Một số tác giả thử nghiệm tác dụng chống tắc nghẽn mạch ở mức độ s u trên động vật thực nghiệm, nghiên cứu biến đổi hóa học nhằm mục đích làm enzyme bền hơn, nghiên cứu các đặc tính và biến đổi hóa học của enzyme khi đƣa vào cơ thể [50].

Từ năm 2002 đến 2003, các nhà khoa học Trung Quốc cũng tách chiết đƣợc enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin cao từ loài giun E. fetida [45,60]. Họ đã chứng minh rằng các enzyme này có thể sử dụng làm thuốc uống thay thế một số thuốc ch a bệnh tim mạch rất đắt trên thị trường hiện nay như urokinase và tPA.

Cho và cs (2004) đã tinh sạch đƣợc 6 ph n đoạn lumbrokinase (F1 đến F6) từ giun đất L. rubellus có hoạt tính thủy ph n fibrin bằng phương pháp tủa muối ammonium sulfate và sắc k cột. Hoạt tính thủy ph n protein trên cơ chất casein của 6 isoenzyme này đạt đƣợc từ 11,3-167,5 U/mg xếp theo thứ tự hoạt tính F2>F1>F5>F6>F3>F4. Hoạt tính thủy ph n fibrin của 6 ph n đoạn này trên đĩa fibrin đạt được từ 20,8-207,2 U/mg xếp theo thứ tự tương ứng F6>F2>F5>F3>F1>F4. Khối lƣợng ph n tử của các isozyme đƣợc xác định bằng điện di SDS-PAGE tương ứng là 24,6 (F1); 26,8 (F2); 28,2 (F3); 25,4 (F4); 33,1 (F5) và 33,0 kDa (F6). Nhiệt độ tối ƣu của 6 isozyme là 50C, và pH tối ƣu trong vùng pH 4-12. Bốn isozyme (F1-F4) hoàn toàn bị ức chế bởi PMSF. Hai enzyme F5-F6 hoàn toàn bị ức chế bởi aprotinin, N-p-torsyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK), N-torsyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK), soybean trypsin inhibitor (SBTI), lima bean trypsin inhibitor (LBTI) và leupeptin [12].

Sun và cs (2006) đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ của lumbrokinase chống lại chứng thiếu máu cục bộ cơ tim ở chuột và tiến tới nghiên cứu cơ chế của nó. LK đã làm giảm chứng nhồi máu cơ tim phụ thuộc vào các liều khác nhau. Tốc độ hạn chế của LK ở các liều 20, 40 và 80 mg/kg thể trọng tương ứng là 7,7%; 34,6% và 46,2%. Các nghiên cứu về điện t m đồ cho rằng, khi dùng LK ở nồng độ 10 và 50 l ở 10 mV, dòng canxi dạng L (ICa-L) của cơ tim đã giảm rõ ràng tương ứng từ - 14,42±1,5 pA/pF tới -11,33±1,4 pA/pF (giảm tới 21,4%, có nghĩa thống kê với p<0,01) và -9,92 ± 1,31 pA/pF (giảm 36,5%, có nghĩa thống kê với p<0,01). Cơ

Vũ Thị Bích Ngọc 14 Cao học K20 chế chống chứng thiếu máu cục bộ làm giảm dòng canxi dạng L (ICa-L) của cơ tim ở t m thất chuột nhắt trắng [58].

Ƣu điểm lớn nhất của enzyme thủy ph n fibrin từ giun đất là có thể hấp thụ qua đường ruột vào máu. Khi vào trong máu, enzyme này vừa có tác dụng hoạt hóa hệ thống thủy ph n fibrin, vừa có hoạt tính plasmin hòa tan trực tiếp fibrin. Đ y chính là nh ng cơ sở của các nghiên cứu ứng dụng enzyme thủy ph n fibrin từ giun đất làm thuốc uống ch a bệnh tim mạch [21,50,57].

Hình 1.4. Cấu trúc bậc 3 của lumbrokinase tách chiếttừ các loài giun đất

Từ việc ph n tích protein của các loài giun đất cho thấy, cấu trúc bậc 3 của các isoenzyme lumbrokinase từ loài L. rubellus có rất nhiều điểm giống nhau so với các protein từ loài E. fetida ở các xoắn α, nếp gấp β và các đoạn cuộn xoắn (Hình 1.4) [46]. Một phần trình tự acid amin của LK giống với trình tự amino acid cùng vị trí của các serine protease tương tự trypsin bao gồm: elastase, yếu tố đông máu IX, trypsin, kallikrien và chymo trypsin [49].

Cơ chế hoạt động của lumbrokinase bao gồm việc kích hoạt plasminogen giống nhƣ các yếu tố hoạt hóa mô t-PA khác và ph n hủy trực tiếp fibrin (Hình 1.5), nhưng không ph n hủy các protein huyết tương bao gồm plasminogen và albumin.

.

Vũ Thị Bích Ngọc 15 Cao học K20 Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của lumbrokinase

Khả năng hấp thu lumbrokinase qua thành ruột non trên thỏ cũng đã đƣợc chứng minh. Lumbrokinase tinh khiết pha trong dung dịch đệm Krebs-Henseleit ở các nồng độ khác nhau lần lƣợt là 0,5; 1,0; và 2,0 mg/ml đã đƣợc đƣa vào bên trong niêm mạc ruột của thỏ trong các khoảng thời gian khác nhau (30, 60, 120 phút). Xác định khả năng tiêu sợi huyết bằng cách lấy dịch bên ngoài niêm mạc ruột thỏ sau các khoảng thời gian và nhỏ lên đĩa fibrin theo dõi vòng hoạt tính. Kết quả cho thấy, sau hai giờ theo dõi, vòng hoạt tính trên đĩa fibrin đạt 21,798 ± 11,0; 22,118 ± 0,4;

11,8 ± 31,977 mm2. Khi nhỏ trực tiếp lumbrokinase ở các nồng độ khác nhau lên đĩa fibrin, diện tích vòng hoạt tính lần lượt là 148,3; 253,5; 276,2 mm2 tương ứng với 14,7; 8,7 và 11,5% lumbrokinase đƣợc chuyển từ bên trong ra bên ngoài niêm mạc ruột non. Điều đó chứng tỏ rằng, lumbrokinase đƣợc hấp thu hiệu quả qua thành ruột non vào máu và thích hợp làm nguyên liệu sản xuất thuốc trị tắc nghẽn mạch máu qua đường uống [66].