3.4. ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA rLK
3.4.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK
pH môi trường ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa các gốc hydrocacbon của các acid amin trong ph n tử enzyme, ion hóa các nhóm chức trong trung t m hoạt động, ion hóa cơ chất, do đó ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt tính rLK, dịch enzyme rLK được pha trong các đệm 20 mM acetate (pH 3- 5,5), phosphate (pH 6- 8) và tris- HCl (pH 8,5- 11), để ổn định ở
Vũ Thị Bích Ngọc 62 Cao học K20 nhiệt độ phòng trong 30 phút, nhỏ dịch lên đĩa fibrin, ủ 37oC trong 5 giờ và xác định hoạt tính còn lại. Mẫu đối chứng là các đệm với các giá trị pH tương ứng không chứa enzyme rLK.
Nhận thấy, khi tăng pH từ 3- 6, hoạt tính enzyme tăng dần. Hoạt tính enzyme cao nhất trong khoảng pH từ 7- 8 (hoạt tính tương đối là 100%). Hoạt tính enzyme giảm nhanh khi pH tăng từ 8,5- 11 (hoạt tính còn lại 6% ở pH 11). Nhƣ vậy, enzyme hoạt động tối ƣu trong khoảng pH từ 6,5- 8 (Hình 3.16).
So sánh với kết quả nghiên cứu của Cho và cs (2004), đối với enzyme LK tách chiết từ giun đất L. rubellus, tại pH 2, hoạt tính enzyme mất hoàn toàn, hoạt tính còn 70- 80% tại pH 3 và pH 12, 90% ở pH 9-11, khoảng pH tối ƣu là 7-8 [12].
Như vậy, rLK theo nghiên cứu của chúng tôi hoạt động trong khoảng pH tương đồng với enzyme tách chiết từ tự nhiên.
Hình 3.16. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme rLK
Độ bền của enzyme cũng phụ thuộc vào trạng thái ion hóa phân tử. Để xác định độ bền enzyme ở các pH khác nhau, dịch enzyme đƣợc pha vào đệm potassium phosphate, pH 6-8, ủ trong 10- 60 phút, sau đó các dịch enzyme đƣợc nhỏ lên đĩa fibrin, ủ phản ứng ở 37oC trong 5 giờ. Đo diện tích vòng phản ứng và xác định hoạt tính còn lại.
Vũ Thị Bích Ngọc 63 Cao học K20 Hình 3.17. Ảnh hưởng của pH lên độ bền enzyme rLK
Hoạt tính giảm dần theo thời gian, ở pH 6, hoạt tính enzyme còn lại 53% sau 60 phút ủ. Hoạt tính tương đối còn lại 64% ở pH 6,5 sau khi ủ 60 phút. Tại các pH 7- 7,5, enzyme rLK khá bền sau 60 phút ủ, hoạt tính còn lại 80- 100%. Trong khi đó, tại pH 8, hoạt tính còn lại 62% sau 60 phút ủ. Điều này chứng tỏ enzyme bền ở khoảng pH trung tính. Kết quả cho thấy enzyme rLK trong nghiên cứu kém bền hơn so với kết quả nghiên cứu của Hu và cs (2005) rằng rLK bền dưới 60oC trong khoảng pH rộng là 2- 11 [29]. Theo nghiên cứu của Cho và cs (2004) thì LK tách chiết từ giun đất L. rubellus cũng bền ở khoảng pH 4-12 [12].
Kết quả có sự tương đồng với nghiên cứu của L Thị Bích Thủy và cs (2006), enzyme tách chiết từ giun quế P. excavatus có hoạt tính mạnh nhất ở 50oC tại pH 7- 7,5 và giảm dần ngoài khoảng pH này. Khi ủ ở 60oC thì hoạt tính enzyme còn lại ở pH 6- 8,5, ủ ở 80oC thì hoạt tính còn lại 7% với pH trung tính và mất hoàn toàn với các khoảng pH kiềm và axit [4].
Vũ Thị Bích Ngọc 64 Cao học K20 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Thiết kế thành công vector biểu hiện pPLK, đúng khung đọc, trình tự gen lk đúng theo thiết kế, đủ điều kiện để biến nạp và biểu hiện trong nấm men P.
pastoris X33.
2. Biểu hiện thành công protein tái tổ hợp rLK có hoạt tính thủy ph n fibrin đạt 2,47 U/mg. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp lumbrokinase với môi trường YPTCM, 96 giờ nuôi cấy, cảm ứng 1% methanol sau mỗi 24 giờ cho hoạt tính enzyme cao nhất đạt 2,94 U/mg.
3. Tinh sạch được rLK qua cột resin có kích thước 47 kDa, độ sạch đạt 1,22 lần và hiệu suất tinh sạch đạt 12,96%. Nhận dạng rLK bằng kĩ thuật Maldi- Tof (MS/ MS) khẳng định chính xác protein tinh sạch đƣợc chính là lumbrokinase.
4. Enzyme rLK bền với nhiệt độ 30- 40oC. Nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng enzyme là 37- 40oC. Enzyme hoạt động mạnh và bền ở pH trung tính.
Kiến nghị
1. X y dựng quy trình lên men sản xuất rLK lƣợng lớn từ chủng nấm men tái tổ hợp P. pastoris XpPLK .
2. Thử nghiệm, đánh giá chất lƣợng của chế phẩm rLK tinh sạch đƣợc, định hướng trong sản xuất thuốc điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu.
Vũ Thị Bích Ngọc 65 Cao học K20 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Phạm Thị Minh Đức (2007), Sinh lý học, NXB Y học, Hà Nội.
2. Nguyễn Thế Khánh và Phạm Tử Dương (1997), “Xét nghiệm sử dụng trong l m sàng”, NXB Y học, Hà Nội.
3. Bùi Phương Linh, Đỗ Thị Tuyên và Quyền Đình Thi (2013), “Nh n dòng và biểu hiện gen mã hóa LK từ giun đất L. rubellus ở E. coli. ”, Hội nghị khoa học CNSH Toàn quốc. Nxb Khoa học và Công nghệ, Hà Nội, tr. 128-132.
4. L Thị Bích Thủy, Đỗ Thị Tuyên và Nguyễn Thị Ngọc Dao (2006), “Tinh sạch và xác định một số tính chất của enzym thuỷ ph n fibrin đƣợc tách chiết từ loài trùn quế Perionyx excavatus”, Tạp chí Sinh học, 28 (3), tr. 77-82.
5. Lê Văn Triển (1995), Khu hệ giun đất miền Đông Bắc Việt Nam, Luận án Tiến sĩ sinh học, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Hà Nội.
6. Phan Thị Bích Tr m, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn và Phạm Thị Ánh Hồng (2008), “Khảo sát đặc điểm các serine- protease từ trùng quế Perionyx excavatus”, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV. Hóa sinh và sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công nghiệp thực phẩm, tr. 123-127.
Tài liệu tiếng Anh
7. Ambrus, C.M., N. Back, and J.L. Ambrus (1962), “On the mechanism of thrombolysis by plasmin”, Circulation research, 10, pp. 161-165.
8. Andrianova, I.V., V.G. Ionova, et al. (2001), “Use of allikor for the normalization of fibrinolysis and hemostasis in patients with chronic cerebrovascular diseases”, Klinicheskaia meditsina, 79 (11), pp. 55-58.
9. Astrup, T. and S. Mullertz (1952), “The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity”, Archives of biochemistry and biophysics, 40 (2), pp. 346-351.
Vũ Thị Bích Ngọc 66 Cao học K20 10. Bassam, B.J., G. Caetano-Anolles, and P.M. Gresshoff (1991), “Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels”, Analytical biochemistry, 196 (1), pp. 80-83.
11. Bradford, M.M. (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”, Analytical biochemistry, 72, pp. 248-254.
12. Cho, I.H., E.S. Choi, H.G. Lim, and H.H. Lee (2004), “Purification and characterization of six fibrinolytic serine-proteases from earthworm Lumbricus rubellus”, Journal of biochemistry and molecular biology, 37 (2), pp. 199-205.
13. Choi, H.S. and Y.S. Sa (2001), “Fibrinolytic and antithrombotic protease from Spirodela polyrhiza”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 65 (4), pp.
781-786.
14. Coll-Sangrona, E. and C.L. Arocha-Pinango (1998), “Fibrinolytic action on fresh human clots of whole body extracts and two semipurified fractions from Lonomia achelous caterpillar”, Brazilian journal of medical and biological research, 31 (6), pp. 779-784.
15. Craven, L.L. (1950), “Acetylsalicylic acid, possible preventive of coronary thrombosis”, Annals of western medicine and surgery, 4 (2), pp. 95.
16. Cregg, J.M., K.R. Madden, K.J. Barringer, G.P. Thill, and C.A. Stillman (1989), “Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris”, Molecular and cellular biology, 9 (3), pp. 1316-1323.
17. Daly, R. and M.T. Hearn (2005), “Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production”, Journal of molecular recognition : JMR, 18 (2), pp. 119-138.
18. Dametto, M., A.P. David, et al. (2000), “Purification and characterization of a trypsin-like enzyme with fibrinolytic activity present in the abdomen of horn fly, Haematobia irritans irritans (Diptera: Muscidae)”, Journal of protein chemistry, 19 (6), pp. 515-521.
Vũ Thị Bích Ngọc 67 Cao học K20 19. Dong, G.Q., X.L. Yuan, Y.J. Shan, Z.H. Zhao, J.P. Chen, and Y.W. Cong (2004), “Molecular cloning and characterization of cDNA encoding fibrinolytic enzyme-3 from earthworm Eisenia fetida”, Acta biochimica et biophysica Sinica, 36 (4), pp. 303-308.
20. Ellis, S.B., P.F. Brust, P.J. Koutz, A.F. Waters, M.M. Harpold, and T.R.
Gingeras (1985), “Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatable genes from the yeast Pichia pastoris”, Molecular and cellular biology, 5 (5), pp.
1111-1121.
21. Fan, Q., C. Wu, L. Li, R. Fan, Q. Hou, and R. He (2001), “Some features of intestinal absorption of intact fibrinolytic enzyme III-1 from Lumbricus rubellus”, Biochimica et biophysica acta, 1526 (3), pp. 286-292.
22. Francis, C.W. and V.J. Marder (1991), “Fibrinolytic therapy for venous thrombosis”, Progress in cardiovascular diseases, 34 (3), pp. 193-204.
23. Garcia Gomez, L.J. and F.J. Sanchez-Muniz (2000), “Review: cardiovascular effect of garlic (Allium sativum)”, Archivos latinoamericanos de nutricion, 50 (3), pp. 219-229.
24. Ge, T., S.H. Fu, et al. (2007), “High density fermentation and activity of a recombinant lumbrokinase (PI239) from Pichia pastoris”, Protein expression and purification, 52 (1), pp. 1-7.
25. Ge, T., Z.J. Sun, S.H. Fu, and G.D. Liang (2005), “Cloning of thrombolytic enzyme (lumbrokinase) from earthworm and its expression in the yeast Pichia pastoris”, Protein expression and purification, 42 (1), pp. 20-28.
26. Grinna, L.S. and J.F. Tschopp (1989), “Size distribution and general structural features of N-linked oligosaccharides from the methylotrophic yeast, Pichia pastoris”, Yeast, 5 (2), pp. 107-115.
27. Heyman, S.N., Z. Hanna, et al. (2004), “The fibrinolytic system attenuates vascular tone: effects of tissue plasminogen activator (tPA) and aminocaproic acid on renal microcirculation”, British journal of pharmacology, 141 (6), pp. 971-978.
Vũ Thị Bích Ngọc 68 Cao học K20 28. Hu, R., S. Zhang, H. Liang, N. Li, and C. Tu (2004), “Codon optimization, expression, and characterization of recombinant lumbrokinase in goat milk”, Protein expression and purification, 37 (1), pp. 83-88.
29. Hu, Y., X.L. Meng, J.P. Xu, W. Lu, and J. Wang (2005), “Cloning and expression of earthworm fibrinolytic enzyme PM(246) in Pichia pastoris”, Protein expression and purification, 43 (1), pp. 18-25.
30. Hwang, C.M., D.I. Kim, et al. (2002), “In vivo evaluation of lumbrokinase, a fibrinolytic enzyme extracted from Lumbricus rubellus, in a prosthetic vascular graft”, The Journal of cardiovascular surgery, 43 (6), pp. 891-894.
31. Ichinose, A., K. Takio, and K. Fujikawa (1986), “Localization of the binding site of tissue-type plasminogen activator to fibrin”, The Journal of clinical investigation, 78 (1), pp. 163-169.
32. Invitrogen, Pichia expression kit: A manual of methods for expression of recombinant proteins in Pichia pastoris.
33. Invitrogen, pPICZα A, B and C Pichia expression vectors for selection on Zeocin and purification of secreted, recombinant proteins.
34. Irving Innerfield (1960), Enzyme in clinical medicine, McGraw- Hill, New York.
35. Jin, L., H. Jin, G. Zhang, and G. Xu (2000), “Changes in coagulation and tissue plasminogen activator after the treatment of cerebral infarction with lumbrokinase”, Clinical hemorheology and microcirculation, 23 (2-4), pp. 213-218.
36. Kanai, T., N. Ueki, et al. (1997), “Recombinant thermostable cycloinulo- oligosaccharide fructanotransferase produced by Saccharomyces cerevisiae”, Applied and environmental microbiology, 63 (12), pp. 4956-4960.
37. Kim, C.H., H.I. Choi, and D.S. Lee (1993), “Purification and biochemical properties of an alkaline pullulanase from alkalophilic Bacillus sp. S-1”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 57 (10), pp. 1632-1637.
Vũ Thị Bích Ngọc 69 Cao học K20 38. Kim, W., K. Choi, et al. (1996), “Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang”, Applied and environmental microbiology, 62 (7), pp. 2482-2488.
39. Kodama, S., M. Tsujimoto, N. Tsuruoka, T. Sugo, T. Endo, and A. Kobata (1993), “Role of sugar chains in the in-vitro activity of recombinant human interleukin 5”, European journal of biochemistry / FEBS, 211 (3), pp. 903-908.
40. Kotb, E. (2014), “The biotechnological potential of fibrinolytic enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombin”, Biotechnology progress.
41. Koutz, P., G.R. Davis, C. Stillman, K. Barringer, J. Cregg, and G. Thill (1989), “Structural comparison of the Pichia pastoris alcohol oxidase genes”, Yeast, 5 (3), pp. 167-177.
42. Kunamneni, A., T.T. Abdelghani, and P. Ellaiah (2007), “Streptokinase-the drug of choice for thrombolytic therapy”, Journal of thrombosis and thrombolysis, 23 (1), pp. 9-23.
43. Laemmli, U.K. (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature, 227 (5259), pp. 680-685.
44. Lee, S.G., H.Y. Koh, et al. (2010), “Expression of recombinant endochitinase from the Antarctic bacterium, Sanguibacter antarcticus KOPRI 21702 in Pichia pastoris by codon optimization”, Protein expression and purification, 71 (1), pp.
108-114.
45. Liu, X.H. and F. Ge (2002), “Factors influencing the activity of fibrinolytic enzymes from earthworm, Eisenia fetida”, Zhongguo Zhong yao za zhi, 27 (6), pp.
423-426.
46. Mahendra Kumar Verma and K. Pulicherla (2011), “Lumbrokinase - A potent and stable fibrin- specific plasminogen activator ”, International Journal of Bioscience and Biotechnology, 3 (2), pp. 57-70.
47. Mihara, H., H. Sumi, et al. (1991), “A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm, Lumbricus rubellus”, The Japanese journal of physiology, 41 (3), pp. 461-472.
Vũ Thị Bích Ngọc 70 Cao học K20 48. Mousa, S.A. (2010), “Antithrombotic effects of naturally derived products on coagulation and platelet function”, Methods Mol Biol, 663, pp. 229-240.
49. Nakajima, N., K. Ishihara, M. Sugimoto, H. Sumi, K. Mikuni, and H.
Hamada (1996), “Chemical modification of earthworm fibrinolytic enzyme with human serum albumin fragment and characterization of the protease as a therapeutic enzyme”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 60 (2), pp. 293-300.
50. Nakajima, N., H. Mihara, and H. Sumi (1993), “Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 57 (10), pp. 1726-1730.
51. Park, Y., E. Ryu, et al. (1999), “Characterization of antithrombotic activity of lumbrokinase-immobilized polyurethane valves in the total artificial heart”, Artificial organs, 23 (2), pp. 210-214.
52. Resch, K.L. and E. Ernst (1995), “Garlic (Allium sativum)-a potent medicinal plant”, Fortschritte der Medizin, 113 (20-21), pp. 311-315.
53. Sanger, F., G.M. Air, et al. (1977), “Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA”, Nature, 265 (5596), pp. 687-695.
54. Scorer, C.A., R.G. Buckholz, J.J. Clare, and M.A. Romanos (1993), “The intracellular production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, Gene, 136 (1-2), pp. 111-119.
55. Sikri, N. and A. Bardia (2007), “A history of streptokinase use in acute myocardial infarction”, Texas Heart Institute journal, 34 (3), pp. 318-327.
56. Sumi, H., H. Hamada, H. Tsushima, H. Mihara, and H. Muraki (1987), “A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet”, Experientia, 43 (10), pp. 1110-1111.
57. Sumi, H., N. Nakajima, and H. Mihara (1993), “A very stable and potent fibrinolytic enzyme found in earthworm Lumbricus rubellus autolysate”, Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 106 (3), pp. 763-766.
Vũ Thị Bích Ngọc 71 Cao học K20 58. Sun, H.L., J.D. Jiao, Z.W. Pan, D.L. Dong, and B.F. Yang (2006), “The cardioprotective effect and mechanism of lumbrokinase”, Yao xue xue bao, 41 (3), pp. 247-251.
59. Tai, M.W. and B.V. Sweet (2006), “Nattokinase for prevention of thrombosis”, American journal of health-system pharmacy, 63 (12), pp. 1121-1123.
60. Tang, Y., T. Jiang, et al. (2003), “Multi-isomorphous replacement phasing of the earthworm fibrinolytic enzyme component A from Eisenia fetida”, Science in China. Series C, Life sciences / Chinese Academy of Sciences, 46 (3), pp. 263-272.
61. Terashima, M., A. Kubo, M. Suzawa, Y. Itoh, and S. Katoh (1994), “The roles of the N-linked carbohydrate chain of rice alpha-amylase in thermostability and enzyme kinetics”, European journal of biochemistry / FEBS, 226 (1), pp. 249- 254.
62. Tschopp, J.F., P.F. Brust, J.M. Cregg, C.A. Stillman, and T.R. Gingeras (1987), “Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris”, Nucleic acids research, 15 (9), pp. 3859-3876.
63. Wang, Q.Q., J.S. Chen, X.X. Liang, P.X. Qiu, Y.W. Wang, and G.M. Yan (2004), “Hemorrhagic activity and mechanism of FIIa, a fibrinolytic enzyme from Agkistrodon acutus venom”, Acta pharmacologica Sinica, 25 (4), pp. 514-521.
64. Wolf, M. and K. Ransberger (1972), Enzyme therapy, Vantage Press., New York.
65. Xu, Z.R., Y.M. Yang, Q.F. Gui, L.N. Zhang, and L. Hu (2010), “Expression, purification, and characterization of recombinant lumbrokinase PI239 in Escherichia coli”, Protein expression and purification, 69 (2), pp. 198-203.
66. Yan, X.M., C.H. Kim, C.K. Lee, J.S. Shin, I.H. Cho, and U.D. Sohn (2010),
“Intestinal absorption of fibrinolytic and proteolytic lumbrokinase extracted from earthworm, Eisenia andrei”, The Korean journal of physiology & pharmacology : official journal of the Korean Physiological Society and the Korean Society of Pharmacology, 14 (2), pp. 71-75.
Vũ Thị Bích Ngọc 72 Cao học K20 67. Yuan, X., C. Cao, Y. Shan, Z. Zhao, J. Chen, and Y. Cong (2006),
“Expression and characterization of earthworm Eisenia fetida lumbrokinase-3 in Pichia pastoris”, Preparative biochemistry & biotechnology, 36 (3), pp. 273-279.
68. Zhao, M.M., M. Li, Z.L. Han, M. Wang, and L.X. Du (2006), “Cloning and expression of lumbrokinase gene in Pichia pastoris”, Wei Sheng Wu Xue Bao, 46 (4), pp. 581-