1.3. KHÁI QUÁT VỀ ENZYME LUMBROKINASE
1.3.3. Tình hình nghiên cứu lumbrokinase trên thế giới
Nhằm phục vụ thị trường một lượng lớn chế phẩm LK với hoạt tính thủy phân fibrin cao và giá thành thấp, các nhà khoa học trên thế giới đã quan t m nhiều hơn tới việc nhân dòng gen, biểu hiện và sản xuất enzyme LK dạng tái tổ hợp.
Dong và cs (2004) đã nh n dòng và đánh giá tính chất của DNA tái tổ hợp mã hóa cho enzyme-3 (EFE-3) thủy ph n fibrin từ giun đất E. fetida (GenBank:
AY438622). Trong nghiên cứu này, cDNA tái tổ hợp mã hóa cho EFE-3 đƣợc nh n dòng bằng RT-PCR. DNA tái tổ hợp có khung đọc mở (741 nucleotide) mã hóa một protein (247 amino acid). EFE-3 đã chỉ ra mức độ cao của các protease F-III-1, F- III-2 và bovine trypsin. EFE-3 tái tổ hợp đã được biểu hiện trong E. coli dưới dạng thể vùi và gen mã hóa dạng tự nhiên của EFE-3 được tiết ra trong môi trường tế bào
Vũ Thị Bích Ngọc 17 Cao học K20 COS-7. Hai sản phẩm tái tổ hợp này đều ở dưới dạng thể vùi và protease được tiết ra có hoạt tính thủy ph n fibrin. Bên cạnh đó, nhóm tác giả của Cho đã nh n dòng, đọc trình tự và biểu hiện protein thủy ph n fibrin serine- protease từ giun đất L.
rubellus. Lumbrokinase tái tổ hợp có hoạt tính cao khi biểu hiện ở E. coli [19].
Cũng trong năm 2004, Hu và cs đã tối ƣu hóa dòng tế bào, biểu hiện và đánh giá tính chất l hóa của LK tái tổ hợp trong s a dê. Hai gen LK đã đƣợc nh n dòng và tối ƣu hóa đƣa vào vector biểu hiện tế bào tuyến vú pIbCP. Vector pIbCP-LK đã đƣợc trực tiếp đƣa vào tế bào tuyến vú ở dê. Kết quả đã chỉ ra rằng cả hai gen LK-w và LK-m đã đƣợc thể hiện trong s a dê. Hoạt tính thủy ph n fibrin của LK-w trong s a là 225 ±13,2 tPA U/L, trong khi đó LK-m là 550 ±21,6 tPA U/L. Điều này đã chỉ ra việc tối ƣu hóa các dòng tế bào có vai trò quan trọng nhằm n ng cao biểu hiện LK. Khối lƣợng ph n tử của LK tái tổ hợp là 31,8 kDa [28].
Đến năm 2005, Ge và cs đã nh n dòng thành công gen mã hóa lumbrokinase từ giun đất L. bimastus (GenBank: AF433650). Gen này (852 bp) gồm một khung đọc mở mã hóa cho hai phần của protein: một peptide tín hiệu (44 aa) và một peptide thành thục (239 aa). Gen lk đã đƣợc nh n dòng và đƣa vào vector pPICZA, một vector dùng biểu hiện trong nấm men. Bằng phương pháp SDS- PAGE và Western blot, kết quả đã chỉ ra rằng PI239 tái tổ hợp đã tiết vào dịch nuôi cấy và có hoạt tính thủy ph n fibrin [25]
Zhao và cs (2006) đã nh n dòng và biểu hiện thành công lumbrokinase tái tổ hợp ở P. pastoris. Gen lk F238 đã đƣợc khuếch đại bằng RT-PCR từ RNA tổng số của giun đất E. fetida. Gen này bao gồm trình tự peptide tín hiệu đƣợc chèn vào vector pUCm-T tạo plasmid có gắn đoạn chèn pUCm-T-F238. Trình tự lk F238 (738 bp) gồm một khung đọc mở mã hóa một polypeptide (245 aa), gồm đoạn peptide tín hiệu (7 aa) và đoạn peptide thuần thục (238 aa) (GenBank: DQ202401).
Trình tự aa tương đồng với trình tự của L. rubellus F-III-2 là 99%. Đồng thời, trong nghiên cứu này, gen LK F238-m không có trình tự peptide tín hiệu đƣợc khuếch đại bằng PCR dùng khuôn pUCm-T-F238. Plasmid biểu hiện pPIC9-F238-m đƣợc thiết kế bằng cách chèn đoạn gen F238-m vào vector biểu hiện pPIC9. Plasmid pPIC9-
Vũ Thị Bích Ngọc 18 Cao học K20 F238-m đƣợc mở vòng bằng BglII và sau đó đƣợc biến nạp vào chủng P. pastoris GS115 bằng phương pháp xung điện. Các dòng biến nạp được sàng lọc trên đĩa môi trường MM và MD để chắc chắn có sự hội nhập của gen F238-m vào genome của nấm men. Cứ sau 24 giờ methanol nồng độ 0,5% đƣợc cảm ứng để biểu hiện protein tái tổ hợp. Kết quả trên SDS-PAGE đã chỉ ra khối lƣợng ph n tử của LK tái tổ hợp là 28 kDa phù hợp với kích thước tính toán theo l thuyết. Sau khi cảm ứng, hoạt tính thủy ph n fibrin của dịch nổi đã đƣợc xác định bằng đĩa fibrin. Nh ng dòng có hoạt tính thủy ph n fibrin cao (100 U/ml) đã đƣợc thu nhận [68].
Cũng lựa chọn hệ biểu hiện P. pastoris, Yuan và cs (2006) đã biểu hiện và đánh giá tính chất l hóa của lumbrokinase-3 từ giun E. fetida. Trong nghiên cứu này cDNA mã hóa gen LK-3 đã đƣợc nh n dòng, đƣa vào vector pPIC9K và biểu hiện ở P. pastoris GS115 bằng phương pháp xung điện. Mức độ biểu hiện cao của LK-3 trong nấm men đã đƣợc thể hiện ở các giai đoạn cảm ứng khác nhau và thể hiện hoạt tính thủy ph n fibrin của LK-3 tái tổ hợp [67].
Năm 2007, Ge và cs đã biểu hiện thành công lumbrokinase (rPI239) trong P.
pastoris. Hàm lƣợng protein tổng số đạt 0,174 g/l trong dịch lên men.
Lumbrokinase tái tổ hợp rPI239 đã thể hiện hoạt tính ở mô hình in vitro. Hoạt tính in vivo rPI239 đã đƣợc xác định bằng phản ứng thủy ph n fibrin. Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả này đã khẳng định lumbrokinase tái tổ hợp đã đƣợc biểu hiện thành công trong P. pastoris và protein tái tổ hợp này có hoạt tính thủy ph n fibrin ở cả hai mô hình in vivo và in vitro [24].
Cho tới năm 2010, Xu và cs đã thiết kế và biểu hiện thành công đoạn peptide thuần thục của gen LK PI239 trong E. coli. Tác giả đã nh n dòng và đƣa vào vector biểu hiện pET22b(-), rLK đã đƣợc biểu hiện ở dạng thể vùi và có thể sử dụng dạng thể vùi này để tinh sạch. Người ta đã sử dụng urea để hoạt hóa LK tái tổ hợp về dạng tự nhiên. Lumbrokinase tái tổ hợp tinh sạch đƣợc thử nghiệm trên mô hình chuột g y huyết khối, và nhóm tác giả đã đƣa đến kết luận có thể sử dụng rLK để điều trị các bệnh liên quan huyết khối [65].