CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT
Tế bào E. coli DH10B (Invitrogen, Mỹ) đƣợc sử dụng để nhân dòng gen, tế bào P. pastoris X33 (Invitrogen, Mỹ) đƣợc sử dụng để biểu hiện.
Vector pJET1.2/blunt (Fermentas) để nhân dòng, vector pPICZαA (Invitrogen) đƣợc dùng để biểu hiện gen lk.
Gen lk từ loài giun đất Eisenia fetida (AF304199) đƣợc tối ƣu hóa codon phù hợp với hệ biểu hiện P. pastoris (Genscript, Mỹ).
2.1.2. Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết, các enzyme cắt giới hạn đều của các hãng uy tín trên thế giới. Một số hóa chất chính và enzyme đƣợc liệt kê ở bảng 2.1
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Tên hóa chất và enzyme Hãng sản xuất ( nước)
Acrylamide, chloroform, isoamyl alcohol, EDTA, imidazol, sodium acetate, temed, triton X100.
Merck ( Đức)
Agarose, cao nấm men, peptone, potassium phosphate, tris base.
Bio Basic Inc. (Mỹ)
SDS, thrombin, plasmin. Sigma (Mỹ)
Ethidium bromide, probond resin, zeocin. Invitrogen (Mỹ) Thang DNA chuẩn, thang protein chuẩn
Enzyme: EcoRI, RNase, SacI, T4 ligase, Taq polymerase, XbaI, XhoI.
Fermentas (Latvia)
YNB (yeast nitrogen base). Difco, BD (Mỹ)
Vũ Thị Bích Ngọc 25 Cao học K20 2.1.3. Các dung dịch và đệm
Các loại dung dịch và đệm dùng cho thí nghiệm được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn có thành phần, nồng độ đƣợc tóm tắt trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
Dung dịch Thành phần, nồng độ Dung dịch APS 10% ammonium persulfate
Dung dich Bradford gốc 100 ml 95% ethanol, 350 mg coomassie brilliant blue G250, 200 ml 88% phosphoric acid
Dung dịch Bradford working
425 ml H2O, 15 ml 95% ethanol, 30 ml 88% phosphoric acid, 30 ml dung dịch bradford gốc
Dung dịch A Đệm 1,5 M tris HCl, pH 8,8 Dung dịch B Đệm 0,5 M tris HCl, pH 6,8
Dung dịch C 30% acrylamide, 0,8% bis- acrylamide
Dung dịch D 10% SDS, 10 mM EDTA
Dung dịch imidazole 3 M imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6,0
Dung dịch I 50 mM tris HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0 Dung dịch II 0,2 N NaOH, 1% SDS
Dung dịch III 3 M potassium acetate, pH 5,5
Dung dịch IV 2% triton X100; 1% SDS; 100 mM NaCl; 10 mM tris HCl; 1 mM EDTA
Dung dịch 24:1 24 chloroform : 1 isopropanol (v/v) Dung dịch nhuộm DNA 0,1 ug/ml ethidium bromide
Dung dịch nhuộm PAGE 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v) methanol;
10% (v/v) acid acetic
Dung dịch tẩy PAGE 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acid acetic
Dung dịch A1 50% methanol; 5% acid acetic; 0,037% formaldehyde Dung dịch A2 50% methanol
Dung dịch A3 0,02 % (w/v) Na2S2O3. 5H2O
Vũ Thị Bích Ngọc 26 Cao học K20
Dung dịch A4 0,1% AgNO3
Dung dịch A5 5% Na2CO3+ 0,037 % Formaldehyde Dung dịch A6 5% acid acetic
Đệm điện di Protein 20 mM tris HCl; 192 mM Glycine; 0,1% SDS, pH 8,8 Đệm 5x tra mẫu protein 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol; 0,313 M tris
HCl, pH 6,8; 10% SDS; 10% β-mercaptoethanol Đệm TE 10 mM tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0
Đệm 10x TBE 20 mM EDTA, 900 mM tris borate, pH 8,0
Đệm 6x tra mẫu DNA 0,09% brommophenol blue; 0,09% xylene xyanol (FF), 60% glycerol
Đêm rửa DNA 70% ethanol
Đệm gắn Native Binding Buffer (NBB)
50 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, 10 mM imidazole, pH 8,0 Đệm rửa Native Wash
Buffer (NWB)
50 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazole, pH 8,0 Đệm thôi Native Elution
Buffer (NEB)
50 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, 250 mM imidazole, pH 8,0
2.1.4. Môi trường
Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm đều được pha theo các quy trình và công thức chuẩn, có thành phần và nồng độ nhƣ trong bảng 2.3.
Vũ Thị Bích Ngọc 27 Cao học K20 Bảng 2.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
Môi trường Thành phần
BMM 1,34% YNB; 4.10-5 biotin; 0,1 M phosphate buffer, pH 6,0; 0,5% (v/v) methanol
BMMY YP; 1,34% YNB; 4.10-5 biotin; 0,1 M phosphate buffer , pH 6,0; 0,5%
methanol
MM 1,34% YNB; 4.10-5 biotin; 0,5% methanol MMY YP; 1,34% YNB; 4.10-5 biotin; 0,5% methanol
LB 1% peptone; 0,5% cao nấm men; 1% sodium chloride LB đặc LB, 2% agar
LB lowsalt 1% peptone; 0,5% cao nấm men; 0,5% sodium chloride YP 2% peptone; 1% cao nấm men
YPD YP, 2% glucose YPD đặc YPD, 2% agar
YPDS YPD đặc; 0,1 M sorbitol YPM YP; 0,5% methanol YPG YP, 1% glycerol
YPTM YPM; 0,01% triton X 100 YPCTM YPTM, 1% casaminoacids
2.1.5. Máy móc và thiết bị
Các máy móc và thiết bị đƣợc sử dụng làm thí nghiệm hiện đại và có độ chính xác cao thuộc phòng Công nghệ sinh học Enzyme và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn l m khoa học và công nghệ Việt Nam (bảng 2.4).
Vũ Thị Bích Ngọc 28 Cao học K20 Bảng 2.4. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Tên thiết bị Xuất xứ ( hãng, nước sản xuất)
Bể ổn nhiệt VS 120 CW
Box cấy vi sinh vật Clean Bench TCV.021
Bộ xung điện
Cân phân tích BL10S
Hệ thống chụp ảnh Dolphin doc Hệ thống điên di ngang
Hệ thống điện di đứng Máy đo pH
Máy Votex OSI
Máy lắc rung Provocell
Máy li t m lạnh Hettich Mikro 22R Máy li t m lạnh CF1 RXII
Máy li t m thường
Máy nuôi lắc Certomat HK Máy quang phổ UV 200 Máy PCR gradient Q cycler Nồi khử trùng ES 31
Tủ ổn nhiệt MIR 12 Tủ lạnh 4oC GR N4 VTV Tủ lạnh s u -20oC VCF 280 Tủ lạnh s u -84oC MDF 192
Vision (Hàn Quốc)
Trung t m chuyển giao công nghệ (Việt Nam)
Eppendorf ( Đức) Sartorius (Đức) Wealtec ( Đài Loan) Biorad ( Mỹ)