1.4.1. Khái quát về hệ biểu hiện Pichia pastoris
Trong các hệ biểu hiện đƣợc sử dụng hiện nay, bao gồm: vi khuẩn E. coli, vi khuẩn Bacillus, tế bào động vật có vú, tế bào côn trùng và nấm men P. pastoris, thì vi khuẩn E. coli đƣợc sử dụng nhiều nhất để sản xuất DNA và protein tái tổ hợp.
Tuy nhiên, nhƣợc điểm của hệ biểu hiện này là không có quá trình sửa đổi sau dịch mã như quá trình glycosyl hóa, protein thường cuộn xoắn lỗi, protein không bị glycosyl hóa nên không đảm bảo hoạt tính sinh học [17,44]. Protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong E. coli thường tồn tại ở dạng thể vùi, g y trở ngại cho việc tinh sạch, hoạt hóa khôi phục lại dạng có hoạt tính. Thời gian gần đ y, các nhà nghiên cứu sử dụng nấm men P. pastoris làm hệ vật chủ để biểu hiện protein ngoại bào, thuận tiện hơn trong quá trình tinh sạch dạng có hoạt tính.
P. pastoris là một vi sinh vật nh n chuẩn nên các protein đƣợc biểu hiện ở tế bào này thường được glycosyl hóa và cuộn xoắn chính xác. Hơn n a, P. pastoris dễ nuôi cấy, có thể sinh trưởng đến mật độ tế bào cao và các thao tác di truyền đơn giản hơn nhiều so với nuôi cấy các tế bào động vật [17,32]. Thêm vào đó, vector biểu hiện mang gen ngoại lai có thể đƣợc chèn hiệu quả vào genome nấm men thông qua quá trình tái tổ hợp gi a các đoạn tương đồng tạo dòng tế bào ổn định dể sẵn sàng cho biểu hiện protein ngoại lai. Ƣu điểm n a là P. pastoris có 2 gen aox1 và aox2 (mã hóa cho enzyme alcohol oxidase- AOX) có promoter mạnh cho phép P. pastoris sử dụng methanol nhƣ một nguồn cacbon và nguồn năng lƣợng, tạo điều kiện sản xuất một lƣợng lớn protein đích với kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp hơn hẳn so với các hệ thống biểu hiện nh n chuẩn khác. Cũng nhờ đó, P. pastoris dễ dàng tăng trưởng trong điều kiện môi trường methanol khá cao, trong khi hầu hết các vi sinh vật khác sẽ chết trong điều kiện này. Các promoter AOX đƣợc cảm ứng bởi methanol và bị ức chế bởi glucose. Sự biểu hiện của protein ngoại lai đƣợc kiểm soát bởi promoter AOX1, đồng nghĩa với việc sự biểu hiện protein ngoại lai đƣợc cảm ứng bởi việc bổ sung methanol.
Vũ Thị Bích Ngọc 20 Cao học K20 P. pastoris có 2 gen mã hóa AOX. Gen aox1 chịu trách nhiệm chính cho hoạt tính AOX của tế bào [20,41,62]. Biểu hiện của gen aox1 đƣợc kiểm soát chặt chẽ và tăng nếu nồng độ methanol cao. Gen aox2 tương đồng tới 97% với gen aox1, tuy nhiên lại có hoạt tính AOX thấp. Nếu P. pastoris bị đột biến gen aox1 (ví dụ, chủng P. pastoris KM71), chỉ còn lại aox2, nên sẽ sinh trưởng chậm trên môi trường có methanol (Muts- Methanol utilization slow) [16,41]. Chủng này đƣợc sử dụng để biểu hiện các protein đòi hỏi sự cải biến s u sắc sau dịch mã. Chủng Mut+ (Methanol utilization plus) (ví dụ, chủng P. pastoris X33) là chủng dại có cả 2 gen aox1 và aox2 nên sẽ sinh trưởng tốt trên môi trường có methanol. Do đó, chủng P.
pastoris X33 hay đƣợc sử dụng để biểu hiện protein ngoại lai, thu sản lƣợng protein lớn [32].
P. pastoris (thuộc chi Komagataella) là 1 trong 10 loài nấm men khác nhau đại diện cho 4 chi có khả năng chuyển hóa methanol. Các chi khác bao gồm Candida, Hansenula và Torulopsis. Con đường chuyển hóa methanol ở tất cả các loài nấm men là giống nhau . Trong quá trình chuyển hóa methanol, bước đầu tiên là quá trình oxi hóa methanol thành formaldehyde, sử dụng oxy ph n tử nhờ enzyme alcohol oxidase. Phản ứng này tạo formaldehyde và hydrogen peroxide H2O2. Để tránh ngộ độc H2O2, quá trình chuyển hóa methanol diễn ra trong peroxisome, đ y là nơi cô lập nh ng sản phẩm độc hại của tế bào. Sau đó, formaldehyde tạo ra được chuyển tới tế bào chất để tham gia các con đường trao đổi chất khác. Quá trình chuyển hóa methanol đƣợc miêu tả cụ thể hơn trong hình 1.6.
AOX là một homo-octamer với mỗi tiểu đơn vị chứa 1 co-factor FAD liên kết không cộng hóa trị. Alcohol oxidase có ái lực thấp với O2 và P. pastoris bù lại bằng cách tạo ra một lƣợng lớn enzyme này.
Vũ Thị Bích Ngọc 21 Cao học K20 Hình 1.6. Con đường chuyển hóa methanol trong P. pastoris [32]
Ở chủng P. pastoris, các protein tiết thường được điều khiển bởi tế bào vật chủ nhờ chuỗi trình tự tín hiệu, đƣợc xem nhƣ trình tự tiết nằm trên protein ngoại lai. Trong một số các trình tự tiết khác nhau thì trình tự α- factor nguồn gốc từ S.
cerevisiae đƣợc sử dụng khá rộng rãi và thành công hiện nay [54]. Do đó, các vector biểu hiện sử dụng cho P. pastoris thường mang trình tự tín hiệu này để giúp cho protein tái tổ hợp được tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy.
Ở sinh vật nh n chuẩn, các protein thường được biến đổi sau quá trình dịch mã, điều này có liên quan mật thiết đến hoạt tính của các protein. Sự glycosyl hóa là sự biến đổi thông dụng nhất trong các hệ thống sinh vật nh n chuẩn và nó cần thiết cho các chức năng của protein như sự nhận diện, sự truyền tín hiệu, sự tương tác gi a các protein và tế bào. Đ y là quá trình gắn thêm gốc đường vào ph n tử protein không cần khuôn mẫu theo 2 dạng là glycosyl hóa protein ở vị trí N (N- linked) và glycosyl hóa ở vị trí O (O- linked) [26]. Hai dạng glycosyl hóa này khác nhau không chỉ ở vị trí gắn vào của đường mà còn ở loại đường và số lượng đường được
bổsung. .
Sự glycosyl hóa protein ở vị trí N là quá trình biến đổi sau dịch mã đƣợc bảo tồn ở nấm men và các eukaryote khác. Glycosyl hoá ở vị trí N bắt đầu từ mạng lưới nội chất (ER) với sự chuyển chuỗi oligosaccharide vào vị trí asparagine của một
Vũ Thị Bích Ngọc 22 Cao học K20 protein. Vị trí gắn bao gồm trình tự ba axit amin là Asn-Xaa-Ser/Thr (trong đó, Xaa là aa bất kỳ ngoại trừ proline). Chuỗi oligosaccharide này chứa 3 ph n tử đường glucose ở đuôi không khử của cấu trúc lõi Man9GlcNAc2 gắn vào protein và nó bị cắt bởi các enzyme glucosidase của lưới nội chất và enzyme α-1,2 mannosidase và đi vào bộ máy golgi. Sự glycosyl hóa ở vị trí O là quá trình tạo liên kết cộng hóa trị gi a một monosaccharide với axit amin Ser hay Thr. Tính đặc hiệu của trình tự cho thấy glycosyl hoá ở vị trí O không quyết định sự gấp cuộn và tính tan của protein.
P. pastoris đang ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất các glycoprotein dƣợc phẩm bởi dễ thao tác, dễ sản xuất với quy mô lớn, chi phí sản xuất thấp và chu kỳ sản xuất ngắn. Một ƣu điểm khác là ở Pichia, các protein tiết không có liên kết α1- 3 với mannose, có quá trình glycosyl hóa vào đầu N (8- 14 mannose vào mỗi chuỗi bên) nhƣng không bị glycosyl hóa quá mức nhƣ ở S.
cerevisiae (50- 150 mannose ở mỗi chuỗi bên), do đó, protein đƣợc sản xuất từ Pichia có cấu trúc bậc 4 ít bị sai lệch.
1.4.2. Chuyển gen ngoại lai vào genome nấm men
Quá trình chèn vector biểu hiện vào genome nấm men dựa trên nguyên tắc trao đổi đơn (single crossover) ở các trình tự tương đồng. Vector pPICZα không chứa gen his4 nên việc chèn vector tái tổ hợp chỉ có thể xảy ra ở locus AOX1. Các vector biểu hiện trong P. pastoris thường chứa một đoạn DNA của promoter có chứa điểm cắt giới hạn đặc biệt, có tác dụng hướng vector đã mở vòng tích hợp vào genome (Hình 1.8).
Vũ Thị Bích Ngọc 23 Cao học K20 Hình 1.7. Hiện tƣợng tích hợp gen ngoại lai vào vị trí 5’AOX1
hoặc aox1::ARG4 của genome nấm men P. pastoris [32]
Đầu tiên, vector cần đƣợc mở vòng tại locus 5’ AOX1 bằng 1 trong 3 loại enzyme: SacI, PmeI hoặc BstXI [33]. Tiếp đó, vector đƣợc mở vòng này sẽ chèn vào vùng 5’ AOX1 hoặc 5’ aox1 ở genome nấm men. Do đó, chủng biểu hiện đƣợc
sử dụng sẽ quyết định chủng tái tổ hợp cho phép chuyển hóa methanol mạnh (Mut+) hay yếu (MutS). Nếu sử dụng chủng biểu hiện P. pastoris Mut+ mà xảy ra
trao đổi kép sẽ thay thể hẳn vùng AOX1 trong genome nấm men thì chủng tái tổ hợp nhận đƣợc sẽ có kiểu hình MutS[32].