CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.13. Xử lí DNA plasmid bằng enzyme cắt giới hạn
Nguyên lý: Để kiểm tra dòng plasmid lựa chọn có mang sản phẩm mong muốn hay không, các plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc đƣợc cắt bằng các enzyme giới hạn. Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt sợi DNA kép ở một trình tự nucleotide đặc hiệu, ở điều kiện nhiệt độ thích hợp (thường là 37oC, tùy thuộc từng loại enzyme). Các enzyme này đƣợc thiết kế ở hai đầu của đoạn gen ngoại lai.
Tiến hành: Hỗn hợp phản ứng cắt được trộn với tỉ lệ sử dụng theo hướng dẫn của hãng sản xuất. Ủ trong 2-3 giờ ở 37oC, sau đó điện di kiểm tra trên gel 0,8%
agarose.
2.2.14. Tinh sạch DNA từ gel agarose Nguyên lý:
Sử dụng loại cột có chứa các hạt sepharose để bắt gi các phân tử DNA sợi kép đƣợc gắn với các loại ion trong đệm gắn (Binding buffer- BB). Khi hỗn hợp DNA đi qua cột, các phân tử DNA sẽ gắn vào mạng lưới, các thành phần khác như protein, muối… sẽ bị rửa trôi bằng đệm rửa (Wash buffer- WB). Sau đó, để tách DNA ra khỏi cột người ta sử dụng loại đệm có độ ion hóa thấp là đệm thôi mẫu (
Vũ Thị Bích Ngọc 38 Cao học K20 Elution buffer- EB). Có thể thay thể đệm này bằng nước khử ion vô trùng, nước có khả năng tạo nên một lớp vỏ hydrate và tách DNA ra khỏi cột
Tiến hành: Quá trình tinh sạch sử dụng kit tinh sạch Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc). Thu phần gel có DNA quan tâm vào ống eppendorf khử trùng. Bổ sung 2 lần thể tích đệm gắn DNA (BB). Ủ hỗn hợp ở 60oC cho tới khi gel tan hoàn toàn. Dùng pipet hút dịch đƣa vào cột (có kèm theo kit của hãng), để ở nhiêt độ phòng 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút, loại bỏ dịch dưới ống. Bổ sung 500 μl đệm rửa (WB chứa 70% ethanol), để 30 giây ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút để loại bỏ hết cồn. Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 40 μl đệm EB hoặc nước khử ion vô trùng, gi ở nhiệt độ phòng 5 phút để DNA đƣợc hòa tan hoàn toàn. Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút thu DNA. Sản phẩm đƣợc điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose và bảo quản DNA ở -20oC.
2.2.15. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào nấm men bằng phương pháp xung điện
Nguyên lý: Dưới tác dụng của nguồn điện, thành tế bào nấm men thay đổi, tạo điều kiện cho DNA plasmid đi vào dễ dàng. Vector tái tổ hợp đƣợc hội nhập với genome tại điểm AOX1.
Tiến hành:
Chuẩn bị tế bào khả biến P. pastoris X33: Một khuẩn lạc nấm men đƣợc nuôi cấy trong môi trường YPD lỏng, lắc 200 rpm, 30oC, qua đêm. Tiếp giống 0,2%
vào 20 ml YPD lỏng, nuôi lắc trong vòng 16-18 giờ, OD600nm đạt 1,4- 1,6. Dịch nuôi đƣợc để lạnh 30 phút cho ổn định. Ly tâm 4000 vòng/phút, trong 5 phút thu tế bào.
Tế bào đƣợc rửa với H20 cất vô trùng, ly tâm 4000 vòng/phút, trong 5 phút thu tế bào. Lặp lại bước này 2 lần. Tế bào được bổ sung 1 M sorbitol, ly tâm 4000 vòng/phút, trong 5 phút thu tế bào. Tế bào sạch đƣợc hòa tan trong 100 μl 1 M sorbitol chuẩn bị cho biến nạp.
Chuẩn bị vector biểu hiện pPLK mở vòng: Để biến nạp pPLK vào P. pastoris X33, pPLK đƣợc cắt mở vòng tại AOX1 bằng enzyme SacI. Hỗn hợp phản ứng 100
Vũ Thị Bích Ngọc 39 Cao học K20 μl (50 μl plasmid, 10 μl đệm 10x SacI, 5 μl SacI (5 U), 35 μl H2O), đƣợc ủ 37oC qua đêm. pPLK/SacI đƣợc tinh sạch bằng kit tinh sạch Thermo Scienticific (Quy trình tương tự như tinh sạch DNA gel agarose). Sản phẩm sau tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose và chuẩn bị cho biến nạp.
Biến nạp plasmid vào P. pastoris X33: Dịch tế bào khả biến đƣợc bổ sung dịch plasmid tái tổ hợp đã xử lý với SacI. Để hỗn hợp ổn định 15 phút, chuyển vào cuvette (khử trùng) để xung điện với điều kiện: 1,5 kV, 25 uF, 200 Ω. Bổ sung ngay 1 ml 1 M sorbitol, để lạnh 15 phút. Chuyển toàn bộ dịch biến nạp sang ống eppendorf khử trùng, ủ 30oC trong 1-2 giờ. Dịch biến nạp đƣợc trải trên đĩa YPDS agar chứa 100 μg/ml zeocin, ủ 30oC trong vòng 3-5 ngày. Khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch chứa gen kháng zeocin được nuôi trong môi trường YPD có bổ sung 100 μg/ml zeocin để tách DNA kiểm tra gen chèn.
2.2.16. Tách chiết DNA tổng số nấm men
Nguyên lý: Tế bào đƣợc phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy mạnh. Loại protein bằng chloroform: isoamyl và thu DNA nấm men bằng cách kết tủa với isopropanol.
Tiến hành: Tế bào nấm men được nuôi trong 5 ml môi trường YPD qua đêm ở 28oC, lắc 200 rpm. Dịch nuôi đƣợc ly tâm 8000 vòng/phút, trong 5 phút, thu cặn tế bào. Bổ sung vào cặn 300 μl dung dịch IV, lắc nhẹ cho tan. Hỗn hợp đƣợc ủ - 84oC, 15 phút, sau đó cho ngay vào 95oC, ủ 1 phút, lặp lại 3 lần. Hỗn hợp đƣợc bổ sung tiếp 250 μl dung dịch 24:1, lắc kỹ và ly tâm 12000 vòng/phút, trong 20 phút.
Dịch trên đƣợc thu sang ống mới, bổ sung 300 μl ammonium acetate, để lạnh 15 phút, ly tâm 12000 vòng/phút, trong 10 phút, thu dịch trên. DNA đƣợc tủa bằng 600 μl isopropanol, ủ -84oC, 10 phút, ly tâm thu tủa ở 12000 vòng/phút, trong 10 phút. Tủa đƣợc rửa với ethanol 70%, ly tâm thu tủa, để khô ở 37oC. Sau đó, tủa đƣợc hòa trong 30 μl TE và 0,25 μl RNase, ủ 37oC trong 15 phút.
Vũ Thị Bích Ngọc 40 Cao học K20 2.2.17. Điện di protein trên gel polyacrylamide ( SDS- PAGE)
Nguyên lý: Gel polyacrylamide đƣợc sử dụng để điện di protein với nồng độ 12,5% polyacrylamide theo phương pháp điện di biến tính của Leammli và cs (1970) [43]. Theo đó, các phân tử protein trong môi trường có SDS bị duỗi thẳng và tích điện âm, do vậy sê di chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử của chúng.
Tiến hành:
Chuẩn bị bản gel: Bản gel gồm 2 lớp, lớp dưới là gel tách được đổ cách mặt trên 1,5 cm, để đông hoàn toàn trong 30 phút, đổ tiếp lớp gel cô phía trên, cài lƣợc để định vị từng giếng riêng biệt, để 30 phút cho bản gel đông hoàn toàn và ổn định.
Thành phần gel nhƣ bảng 2.6.
Bảng 2.6. Thành phần gel polyacrylamide 12,5%
STT Thành phần Gel tách (ml) Gel cô(ml)
1 H20 khử trùng 1,94 1,18
2 Dung dịch A 1,5
3 Dung dịch B 0,5
4 Dung dịch C 2,5 0,3
5 Dung dịch D 0,06 0,02
6 APS 0,024 0,01
7 TEDMED 0,005 3,5
Biến tính mẫu: Mẫu protein đƣợc bổ sung đệm xử lý mẫu dye 6x với tỷ lệ mẫu/ dye là 5/1, biến tính ở 95oC, 10 phút.
Vũ Thị Bích Ngọc 41 Cao học K20 Điện di: Bản gel được lắp vào hệ thống điện di và chạy với cường độ dòng điện là 20 mA cho lớp gel cô và 35 mA cho lớp gel tách trong 45 phút. Sau điện di, bản gel đƣợc tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 1- 3 giờ, tẩy màu bằng dung dịch tẩy, hoặc nhuộm với 0,1% (w/v) AgNO3 theo quy trình của Bassam và cộng sự (1991) có biến đổi [10] nhƣ sau: Ng m bản gel trong dung dịch A1, lắc nhẹ 20 phút để cố định bản gel. Lắc tiếp với dung dịch A2 trong 10 phút. Rửa với H2O cất bằng cách lắc nhẹ trong 10 phút. Chuyển bản gel vào dung dịch A3, lắc nhẹ trong 1 phút, sau đó rửa sạch bản gel 3 lần với H20 cất trong 1 phút. Nhuộm bản gel với dung dịch A4 trong tối 30 phút. Rửa bản gel 3 lần với H20 cất trong 1 phút. Hiện màu bản gel với dung dịch A5, lắc nhẹ nhàng cho đến khi băng xuất hiện. Dừng phản ứng hiện màu với dung dịch A6. Rửa bản gel với nước cất, quan sát kết quả bằng mắt thường.
2.2.18. Nhận dạng protein ngoại lai bằng kĩ thuật MALDI- TOF (MS/ MS) (Matrix-assisted laser desorption ionization- Time of flight)
Khối phổ là kỹ thuật ph n tích đo phổ về khối lƣợng của các ph n tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các ph n tử tích điện khác nhau và đƣợc ph n tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z. D liệu phổ khối đƣợc tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các công cụ tin sinh học. Có 2 loại nguồn ion hóa mẫu hay đƣợc sử dụng đó là nguồn MALDI và ESI. MALDI là thuật ng chỉ phương pháp ion hóa mẫu hấp thụ dựa trên sự hỗ trợ của các chất nền và năng lƣợng laser (Matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI). Nguồn MALDI sử dụng các chất nền hỗ trợ để ion hóa mẫu dưới tác dụng của năng lƣợng laser lớn.
2.2.19. Giải trình tự nucleotide
Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, ph n đoạn chèn đƣợc giải trình tự theo nguyên lý của Sanger (1977) dựa trên các dideoxynucleotide. DNA polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào mạch đơn đang tổng hợp vào đầu 3’- OH, khi gặp
Vũ Thị Bích Ngọc 42 Cao học K20 dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3’- OH, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Nồng độ mỗi dideoxynucleotide đƣợc xác định thận trọng để đảm bảo sự gắn hỗn hợp các chuỗi đang tổng hợp tại mỗi vị trí có thể và không gắn ở vị trí đầu tiên của nucleotide bổ trợ của khuôn. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thước hơn kém nhau một nucleotide [53]
2.2.20. Xử lý số liệu
Phần mềm Microsoft Excel đƣợc sử dụng để xử lý số liệu thu đƣợc trong quá trình thực nghiệm và tính giá trị của các tham số thống kê.
Chương trình Edit-SeqDNAStar và BioEdit- Seq được dùng để phân tích, so sánh trình tự nucleotide và amino acid tương ứng.