1.3. Các phương pháp phát hiện Aflatoxin
1.3.1. Phương pháp phát quang sinh học (Hamed K.Abass và cộng sự, 2004)
- Sự phát huỳnh quang màu xanh của chủng chứng aflatoxin được sử dụng cho phương pháp định tính chủng sản xuất độc tố aflatoxin từ nấm Aspergillus trên môi trường thích hợp. Một số phương pháp sử dụng môi trường rắn như PDA, CCA, các phương pháp khác sử dụng môi trường lỏng bao gồm môi trường có khả năng sản xuất aflatoxin (APA) và môi trường corn steep liquor đã phát triển một phương pháp huỳnh quang đơn giản cho các độc tố aflatoxin trong việc sử dụng chủng trong môi trường rắn.
- Với kỹ thuật của Cotty, aflatoxin được định lượng trong một ống chứa mẫu bằng cách đo huỳnh quang trong một mật độ. Phương pháp phân lập và cô lập mẫu cũng được tiến hành.
28
- Filtenborg và Frisvad đã tiến hành cấy trong môi trường GY, trong đó có glucose và cao nấm men dùng để nuôi cấy Aspergillus spp. tạo aflatoxin. Một miếng nhỏ cắt từ môi trường thạch và trực tiếp đặt lên tấm TLC. Sau khi phát triển ở dung môi thích hợp, điểm aflatoxin được phát hiện dưới ánh sang tia cực tím ở bước sóng dài.
- Yabe và cộng sự (1987) sử dụng môi trường GY như một phương pháp đơn giản để sàng lọc các loài sản xuất aflatoxin bằng tia cực tím. Nó có thể phát hiện việc sản xuất độc tố aflatoxin bởi các bào tử nhỏ chỉ có ở 36 giờ và nhiều bào tử có thể tìm thấy trên các đĩa.
- Tia cực tím cũng có thể được sử dụng như một phương pháp cho việc nhanh chóng xác định chủng sản sinh aflatoxin.
- Các chủng sản xuất aflatoxin độc lập được tìm thấy là các điểm màu xám hoặc đen trong các bức ảnh chụp ở bước sóng tia cực tím, trong khi các chủng không sản xuất aflatoxin là các điểm màu trắng. Aflatoxin B1 và G1 hấp thụ mạnh ánh sang tia cực tím.
1.3.1.2. Phương pháp tăng cường màu huỳnh quang bằng Cyclodextrin
- Sự phát quang màu xanh của aflatoxin B1 dưới tia UV xuất hiện trong môi trường lỏng và rắn và sự phát quang được tăng cường đáng kể bằng cách xử lý với chất hỗ trợ phát quang khác nhau như iot và cyclodextrin. Davis và Diener (1979) đã phát triển một chuỗi hình ảnh phát quang (PFM) sử dụng iot để tăng cường khả năng phát quang của aflatoxin để sử dụng trong HPLC. Sau đó Lemke và cộng sự (1988) đã thực hiện một thí nghiệm nhỏ đơn giản để phát hiện chủng chứa aflatoxin bằng cách nuôi cấy trong môi trường Coconut Cream Agar trong 3-10 ngày bằng cách sử dụng chuỗi PFM với iot. Kết quả của thí nghiệm này đã được kiểm chứng bởi TLC và HPLC. PMF được đưa ra với độ nhạy gấp 100 lần để phát hiện aflatoxin có chứa dẫn xuất iot tốt hơn so với việc không có dẫn xuất.
- Các phát quang của các độc tố aflatoxin B1 và G1 cũng được cải thiện đáng kể khi tăng cường cyclodextrin (CD).
29
- Các đĩa được bổ sung CD được cải thiện khả năng phát quang bằng nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện aflatoxin và mycotoxin.
- Những phương pháp này bao gồm sắc ký lỏng trong đó CD được thêm vào hoặc làm chất rửa cột hoặc các dẫn xuất aflatoxin thô được sàng lọc bằng phương pháp định lượng cho việc phân tích huỳnh quang (Wilson và cộng sự, 2002. Fente và cộng sự,2009) cho thấy rằng việc thêm β-Cyclodextrin vào môi trường một cách thích hợp giúp tăng cường việc tạo aflatoxin bởi Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus bởi ánh sang huỳnh quang ở bước sóng 365 nm. Có thể tăng cường sự phát quang của aflatoxin bằng cách biến đổi trước khi qua cột với Trifluoro-Acetic Acid (TFA) trong HPLC.
1.3.1.3. Phương pháp Yellow Pigment (Thuốc nhuộm vàng)
- Sản phẩm tạo màu vàng cam ở Aspergillus flavus có chứa aflatoxin đầu tiên được xác định bởi Wiseman và cộng sự (1967) bởi vì họ tác động vào sự định lượng mức độ hấp thụ của aflatoxin. Họ phát triển phương pháp để loại bỏ sắc tố từ dịch chiết bằng cách xử lý với CuCO3 không tan. Việc sản xuất sắc tố vàng của A.flavus cũng đã được Arseculeratne và cộng sự (1969) báo cáo, người ta đã quan sát thấy rằng sản xuất sắc tố đáng chú ý bởi ngày thứ 2 ở các chủng trên môi trường CCA (coconut agar). Lin và Dianese (1976) là những người đầu tiên kết hợp việc sản xuất sắc tố vàng với aflatoxin trong A.flavus được phát hiện bởi huỳnh quang màu xanh của aflatoxin trong môi trường. Các sắc tố màu vàng đã được quan sát sớm hơn so với màu xanh huỳnh quang và không quan sát thấy ở các chủng không sinh aflatoxin. Sắc tố màu vàng đã được tiết vào môi trường nhưng nó dễ dàng nhìn thấy trên mặt sau của các chủng được nuôi cấy trên môi trường trong suốt như môi trường PDA.
- Lin và Dianese (1976) báo cáo rằng mức độ sắc tố màu vàng đó là tỷ lệ thuận với màu xanh huỳnh quang trong tất cả các đĩa đã được kiểm tra. Tuy nhiên Davis và cộng sự (1987) đã kết luận rằng sắc tố màu vàng không phải là yếu tố dự báo đáng tin cậy của aflatoxin trong tất cả môi trường. Kết luận này được khẳng định bởi Gupta và Gopa (2002) đã được xác định sự khác biệt giữa các môi trường
30
1.3.1.4. Phương pháp sử dụng hơi Ammonium Hydroxide gây ra sự biến đổi màu sắc
- Saito và Machida (1999) đã giới thiệu một phương pháp mới để nhanh chóng xác định chủng sinh aflatoxin và các chủng không sinh aflatoxin của Asp. flavus và Asp.
parasiticus. Phương pháp này phát triển dựa trên kinh nghiệm và đã được xác nhận bằng cách thử nghiệm trên 120 chủng Asp. flavus và Asp. parasiticus.
- Đối với phương pháp này, một chủng thuần được nuôi cấy tại tâm của đĩa petri chứa môi trường trong suốt như PDA. Các đĩa được đảo ngược và được thêm vào 1-2 giọt dung dịch amoni hydroxit ở nắp đĩa. Mặt dưới của các chủng nhanh chóng đổi sang màu mận đỏ sau khi phía dưới của đĩa petri đã được đảo ngược trên nắp chứa amoni hydroxit. Về cơ bản, không xảy ra sự thay đổi màu sắc ở các chủng không sản sinh độc tố aflatoxin.
- Saito và Machida (1999) đã quan sát sự thay đổi màu sắc khi nuôi cấy các chủng trong môi trường yeast extract – sucrose và coconut media, có sự thay đổi màu yếu hơn môi trường PDA và sự thay đổi màu sắc trên môi trường glucose – muối vô cơ, ưu tiên sản xuất aflatoxin. Tuy nhiên, không có sự thay đổi màu sắc khi quan sát trên môi trường pepton – muối vô cơ và môi trường Czapek.
- Theo điều tra các cơ sở hóa sinh của Saito và Machida, kiểm tra bằng cách sử dụng methanol để trích xuất chất màu từ chủng đông khô của Asp. flavus có chứa aflatoxin được nuôi cấy trên môi trường PDA. Các chiết xuất chứa sắc tố vàng, có lẽ sắc tố vàng giống như là cơ sở của thử nghiệm các chủng chứa aflatoxin của Lin và Dianese (1976). Những sắc tố mận đỏ trộn chung với dung dịch amoni hydroxit hoặc các dung dịch khác như sodium hydroxit, hydoxit kali, natri carbonat, natri bicarbonate. Bổ sung một lượng dư acid để chuyển đổi màu sắc thành vàng chỉ ra rằng sắc tố đóng vai trò như chất chỉ thị pH. Các chức năng chỉ thị pH có thể nhân rộng trong điều kiện thử nghiệm Saito và Machida bằng cách thay thế các giọt dung dịch amoni hydroxit với vài giọt acetic và một lần nữa đảo ngược đĩa petri chứa Asp.flavus. Mặt dưới của
31
các chủng từ mận đỏ trở lại màu vàng hoặc màu xám. Đó có thể là chu kỳ của các chủng qua nhiều thay đổi màu sắc giống như một chỉ thị pH độc lập.
- Tổng cộng có 14 sắc tố màu vàng được tinh chế từ chiết xuất methanol của các chủng Asp. flavus sinh aflatoxin. Cách thanh lọc sắc tố bằng sắc ký lớp mỏng được thực hiện bởi sự thay đổi màu sắc trên khi tiếp xúc với hơi amoni hydroxit. Cấu trúc của bảy sắc tố được xác định bằng phương pháp quang phổ và sắc ký. Chúng bao gồm norsicolonnic acid, averatin, averafin, versicolorin C,versicolorin A, versicolorin A herniacetal và nidurufin. Tất cả lần lượt từ vàng đến đỏ, khoảng pH từ 6,5 trở lên ngoại trừ norsicolonnic acid chuyển từ đỏ sang tím. Tất cả những sắc tố này là anthraquinone trung gian trên con đường sinh tổng hợp aflatoxin (Bhatnagar và cộng sự, 2003; Sinz và Shier, 1991) trừ nidurufin là một sản phẩm phụ được biết đến của các con đường ở một số loài.
- Bảy sắc tố xác định cấu thành phần lớn trong tổng số sắc tố vàng trong chiết xuất của các chủng Asp.flavus sinh aflatoxin. Khi chiết suất được chuẩn bị một các giống hệt nhau từ các chủng Asp. flavus không chứa aflatoxin và kiểm tra bởi sắc ký lỏng cao áp – bằng cách sử dụng phương pháp của Mc Cormick và cộng sự (1988) phát hiện không có sắc tố vàng mặc dù họ đã phát hiện dễ dàng trong các chiết xuất của các chủng chứa aflatoxin.
1.3.1.5. Phương pháp Cyclodextrin kết hợp với Ammonium Hydroxide Vapor - Abbas và cộng sự (2004) đã chứng minh rằng 3 cách để kiểm tra các chủng có sinh
aflatoxin được mô tả ở trên có thể được thực hiện trên cùng đĩa petri và vẫn cho phép lấy mẫu bằng 2 phương pháp phân tích, trong 1 phương pháp β-Cyclodextrin được đưa vào môi trường PDA (β- Cyclodextrin – PDA, 0.3% wt/vol) trong đĩa petri 9 cm.
Các chủng được nuôi cấy tại 28oC đến 35oC trong 4-7 ngày trong bóng tối. Mặt dưới của các chủng dược kiểm tra dưới ánh sáng tự nhiên cho sắc tố màu vàng trong môi trường (Gupta và Gopal, 2002; Lin vad Dianese, 1976). Việc tạo ra aflatoxin cũng được nhận biết bằng ánh sáng huỳnh quang màu xanh ở bước sóng 365 nm của tia UV.
32
- Một miếng thạch nhỏ được đặt trên tấm TLC và được lấy ra sau 10 giây. Những đốm mày được để khô và tấm TLC được để trong chloroform : aceton (93:7) (vol/vol) trong điều kiện hơi bão hòa. Aflatoxin B1, B2, G1, G2 và trực tiếp phát hiện dưới bước sóng dài của tia UV bằng huỳnh quang của chúng. Khoảng 10 miếng thạch (10- 1 gram) được cân và đặt trong lọ nhựa, được chiết với 70% methanol trong 30 phút trên máy lắc ở tốc dộ cao và được ly tâm. Phần nổi là sự hiện diện của aflatoxin được thử bằng ELISA kit, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký lớp mỏng…
- Cuối cùng đĩa petri được lật ngược và thêm 0.5 ml – 25% - 27% ammonium hydroxit trên nắp. Việc tạo ra aflatoxin được phát hiện như sự thay đổi màu sắc ở mặt dưới các chủng từ màu vàng sang đỏ mận.
1.3.1.6. Phương pháp "ELISA test":
- Dựa trên nguyên tắc kháng thể kháng nguyên phát hiện aflatoxin (và các độc tố khác) thông qua những phương tiện phát hiện nhanh, rẻ, dễ thực hiện, sử dụng kháng thể để "bắt" (có lựa chọn) độc tố đặc biệt đã được tách chiết từ hạt hay các thành phần của thức ăn. Sau khi chiết, sẽ sử dụng bộ kiểm tra và thêm chất chỉ định màu.
Cường độ màu sắc sẽ chỉ định có độc tố hay không.