CHƯƠNG II: MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.5. Bố trí thí nghiệm
2.2.5.1. Phân lập vi nấm sinh aflatoxin từ sản phẩm nông nghiệp sau thu hoạch như đậu phộng, đậu nành và hạt cà phê, khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các chủng nấm phân lập.
Nấm tổng hợp aflatoxin được phân lập từ hat đậu phộng, hạt đậu nành và hạt cà phê bị hư như trình bày trên hình 2.1.
Hình 2.1: Sơ đồ chi tiết phân lập vi nấm sinh aflatoxin từ hạt đậu phộng, đậu nành, cà phê hư hỏng, khảo sát khả năng sinh aflatoxin của chúng.
Tăng sinh nấm mốc trên MT thạch nước (WA)
Mẫu hạt đậu phộng, cà phê, đậu nành bị hư được đặt vào đĩa petri có bông thấm nước và sau đó được giữ ở nhiệt độ phòng. Ủ các mẫu hạt này cho đến khi có nấm mọc đều hết hạt. Môi trường sử dụng là WA (Water agar) được hấp khử trùng ở
45
1210C trong 15 phút, đổ đĩa. Rửa mẫu hạt đã ủ bằng nước cất vô trùng, đặt mẫu hạt vào đĩa petri WA, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3 – 7 ngày.
Phân lập chủng nấm trên PDA
Môi trường hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút, được phối vào đĩa petri. Sau khi cấy điểm làm thuần chủng nấm, ủ từ 3 – 5 ngày.
Khảo sát nấm mốc phân lập, định danh sơ bộ
Khảo sát hình thái trên PDA: cấy điểm 1 bào tử ở tâm đĩa Petri đổ môi trường PDA, theo dõi tơ nấm và bào tử đến 7 ngày.
Khảo sát hình thái tế bào: áp dụng phương pháp nuôi cấy phòng ẩm, sau khi nuôi cấy 1 tuần lấy lamelle quan sát dưới kính hiển vi với hệ số phóng đại 100.
Sử dụng môi trường phân biệt để định danh sơ bộ: cấy điểm bào tử nấm mốc vào tâm đĩa thạch AFPA, theo dõi màu khuẩn lạc sau 3 ngày mặt trước và mặt sau đĩa.
Khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các nấm mốc phân lập
Nuôi cấy nấm mốc thu aflatoxin theo Koh và Tseng (1975): Chủng nấm được nuôi cấy trong môi trường Czapek liquid peanut, Gzapek liquid coffee và Gzapek liquid soy bean được chuẩn bị theo phụ lục A, trong bình tam giác chứa 150 ml môi trường, lắc 120 vòng/ phút 12 ngày ở nhiệt độ phòng. Sinh khối thu được sau nuôi cấy được đồng hóa trong 60 ml n-hexan ở 15 phút máy xay sinh tố Toshiba. Bã lọc thu hồi bằng lọc chân không và để khô trong không khí. 10 g bã lọc được trộn với 30 ml n-hexan và 50 ml methanol 55%, sau đó lắc trên máy lắc 30 phút, lọc chân không thu dịch. Lớp n-hexan được loại bỏ. Lớp methanol/ nước còn dư được làm trích ly bằng chloroform 3 lần và rửa bằng nước cất một lần. Pha chloroform (pha nặng) cuối cùng được cô quay thu 10 ml dung dịch chứa aflatoxin.
Sắc ký bản mỏng: sử dụng bản mỏng silicagel kích thước 10x35cm. Hệ dung môi phát triển sắc ký chloroform:methanol theo tỷ lệ thể tích (95:5) cho vào phễu chiết, lắc kỹ. Để yên 1 giờ đến 3 giờ 30 sau đó cho vào bình chạy sắc ký. Dùng mao quản chấm mẫu lên vạch xuất phát. Sau khi lấy bản mỏng ra khỏi bình phát triển sắc
46
ký, sấy khô hoàn toàn trong tủ sấy ở 1050C trong 5 phút. Quan sát dưới tia cực tím bước sóng 254 nm quan sát hiện tượng phát huỳnh quang.
Sắc ký lỏng cao áp: do Viện Y tế Công cộng TP. HCM thực hiện với chuẩn AFB1, AFB2, AFG1, AFG2.
Lựa chọn chủng nấm sinh aflatoxin mạnh nhất: dựa vào kết quả phát huỳnh quang trên TLC, ta chọn ra được chủng nấm sinh aflatoxin mạnh nhất.
Tái nhiễm nấm mốc vào nguồn phân lập, phát hiện aflatoxin: cấy bào tử vào trên hạt đậu phộng, hạt cà phê, hạt đậu nành được hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong 15 phút, trong bình tam giác, bổ sung 1 ml nước cất vô trùng vào chai để giữ ẩm, ủ 5 ngày cho đến khi nấm mọc đầy các hạt, soi UV 254 nm, quan sát khả năng phát huỳnh quang.
Giữ giống nấm mốc trong môi trường thạch nghiêng NA: Môi trường NA được hấp khử trùng 121oC, 1 atm trong 15 phút trong ống nghiệm. Để nghiêng sau đó dùng que cấy vòng cấy nấm vào môi trường. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24- 48 giờ sao cho tơ nấm phát triển. Bảo quản ống thạch nghiêng ở tủ mát 3-5 oC. Cấy chuyển định kỳ 1 lần mỗi tháng.
Giữ giống lạnh sâu (giữ giống trong eppendorf hoặc giữ giống glycerol): Dung dịch glycerol 10% được hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong 15 phút. Hút 1ml dung dịch glycerol vào eppendorf sau đó đục lỗ thạch có đường kính 0.8cm có chứa bào tử cho vào eppendorf. Cuối cùng tiến hành bảo quản lạnh sâu ở -15oC trong 3-5 tháng.
2.2.5.2. Tuyển chọn chủng VK có khả năng đối kháng nấm mốc sinh aflatoxin Sơ đồ bố trí thí nghiệm được trình bày trên hình 2.3.
Tăng sinh vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn phân lập được cấy từ ống thạch nghiêng môi trường NA vào chai 100 ml chứa 10 ml NB được hấp khử trùng ở 1210Ctrong 15 phút, lắc ở 150 vòng/phút trong 24 giờ. Sau khi tăng sinh, dịch nuôi cấy được pha loãng (10-6) và trang trên môi trường NA để thu khuẩn lạc riêng rẽ, ủ 370C trong vòng 3 ngày.
Chuẩn bị VK bằng phương pháp đồng nuôi cấy
47
Các nấm mốc sinh aflatoxin được cấy điểm trên môi trường PDA. Ủ trong 3 ngày. Đục thạch đĩa petri có đường kính 0.8 cm có chứa bào tử nấm đồng thời cấy khuẩn lạc của VK vào 10 ml môi trường NB. Lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ.
Khảo sát khả năng đối kháng nấm mốc của dịch đồng nuôi cấy vi khuẩn và nấm mốc.
Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm sàng lọc tuyển chọn VK đối kháng nấm mốc sinh aflatoxin.
Quy trình khảo sát khả năng đối kháng của VK đối với vi nấm (Magaldi, 2004):
Thực hiện đối kháng nấm mốc như trên, dịch đối kháng là canh trường (dịch đồng nuôi cấy) được bơm 0,1 ml vào 4 lỗ thạch trên đĩa, ủ tiếp 300C trong 24-72 giờ.
Mẫu đối chứng không bổ sung dịch VK ở 4 lỗ thạch. Sau thời gian ủ, 24, 48 và 72
48
giờ, đo đường kính nấm mốc ở đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm. Tỉ lệ ức chế được tính như sau:
I% = (DĐC-DTN)/DĐCx100
Sàng lọc các vi khuẩn có khả năng năng đối kháng cao nhất với nhiều nấm mốc nhất.
Các VK sau sàng lọc được thực hiện quy trình khảo sát khả năng đối kháng của dịch ly tâm loại bỏ sinh khối tế bào.
Chuẩn bị dịch ly tâm canh trường VK sau khi đồng nuôi cấy với nấm mốc chỉ thị sinh aflatoxin
Dịch canh trường VK được chuẩn bị như trên, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút, bỏ sinh khối. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của dịch ly tâm canh trường đồng nuôi cấy VK và nấm mốc như quy trình đối kháng mô tả ở trên.
Khảo sát khả năng đối kháng của VK sàng lọc với nấm mốc sinh aflatoxin bằng dịch nuôi cấy VK có bổ sung tơ nấm làm chất cảm ứng.
VK được nuôi cấy trên môi trường NB1 (xem phụ lục A) có bổ sung tơ nấm chỉ thị sinh aflatoxin (1%), hấp tiệt trùng với tỉ lệ cấy giống 1%, lắc 150 vòng/ phút trong 24 giờ. Canh trường vi khuẩn được ly tâm 4000 vòng/ phút x 15 phút thu dịch nổi. Dịch nổi ly tâm được thực hiện đối kháng nấm mốc theo quy trình mô tả ở trên.
Từ kết quả đối kháng với nấm của dịch canh trường nuôi cấy, dịch ly tâm canh trường nuôi cấy và dịch canh trường nuôi cấy có bổ sung tơ nấm làm chất cảm ứng, tuyển chọn chủng VK đối kháng mạnh nhất trong cả ba trường hợp: sử dụng dịch đồng nuôi cấy, đồng nuôi cấy ly tâm và nuôi cấy có tơ nấm cảm ứng ly tâm.
2.2.5.3. Khảo sát đặc điểm của VK chọn lọc và xác định sản phẩm trao đổi chất kháng nấm
Sơ đồ khảo sát trình bày trên hình 2.4.
Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hóa và khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng VK chọn lọc
Chủng VK chọn lọc được nhuộm Gram bằng tím tinh thể và fuchsin kiềm, VK gram dương bắt màu tím, VK gram âm màu hồng dưới kính hiển vi.
49
Nhuộm bào tử VK bằng malachite green và fushin, tế bào bắt màu hồng, bào tử bắt màu xanh lục.
Thử nghiệm catalase bằng cách nhỏ dung dịch H2O2 trên khuẩn lạc, catalase dương tính khi thấy sủi bọt trên đĩa thạch.
Thử nghiệm Methyl Red bằng cách hấp khử trùng môi trường MR-VP Broth ở 121oC, 1 atm trong 15 phút. Để nguội sau đó cấy khuẩn lạc từ môi trường KIA vào ống nghiệm. Ủ ở 37oC trong 2-5 ngày. Sau đó, thêm vài giọt thuốc thử methyl red vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay. Kết quả dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ. Kết quả âm tính khi môi trường chuyển sang màu vàng.
Thử nghiệm khả năng di động được thực hiện bằng cách cấy điểm VK lên thạch NA chứa 0,5 % agar. Kết quả dương tính khi vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh. Kết quả âm tính khi vi sinh vật chỉ mọc dọc theo đường cấy trong khi môi trường xung quanh vẫn trong.
Các thử nghiệm sinh hóa khác như ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT, H2S, URE, TDA, IND, VP, GEL, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA được khảo sát sử dụng API Kit 20E theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Phụ lục).
50
Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát đặc điểm VK chọn lọc và xác định sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính kháng nấm.
Khả năng tiết enzyme ngoại bào được khảo sát bằng phương pháp khếch tán trên đĩa thạch (well diffusion assay).
Khả năng tiết enzyme amylase, protease, chitinase và -glucanase được khảo sát trên đĩa thạch tinh bột, casein, huyền phù chitin và -glucan.
Chuẩn bị đĩa thạch chứa cơ chất khảo sát: môi trường thạch tinh bột chứa 1%
tinh bột và 2 % agar, thạch casein chứa 1% casein và 2% agar, thạch huyền phù chitin chứa 1 % huyền phù chitin và 2% agar, thạch -glucan chứa 1% -glucan và 2 % agar. Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút, được phối vào đĩa petri, để nguội và đục giếng thạch.
51
Chuẩn bị dịch nuôi cấy VK: VK chọn lọc được cấy vào bình tam giác chứa 10 ml môi trường NB đã hấp khử trùng (tỉ lệ cấy giống), lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ.
0,1 ml dịch tăng sinh được bơm vào giếng thạch (đĩa đối chứng không bơm dịch tăng sinh, chỉ bơm môi trường). Đĩa thạch được ủ ở 370C ủ trong 48 giờ.
Phát hiện enzyme ngoại bào từ VK:
Hoạt tính amylase: tráng bề mặt thạch bằng dung dịch iod (tỉ lệ KI:Iod=3:2), nếu xung quanh giếng thạch xuất hiện vòng màu trắng trên nền xanh là VK tiết enzyme amylase.
Hoạt tính protease dương tính khi môi trường xung quanh đĩa thạch tạo vùng trong suốt, có thể tăng độ tương phản nhờ nhỏ dung dịch TCA 5% (acid Tricloacetic 5g trong 100 ml nước cất) trên bề mặt thạch.
Hoạt tính chitinase dương tính khi môi trường xung quanh giếng thạch trong suốt, có thể tăng độ tương phản nhờ nhỏ dung dịch Iod trên bề mặt thạch.
Hoạt tính -glucanase dương tính khi môi trường xung quanh giếng thạch trong suốt, có thể tăng độ tương phản nhờ nhỏ dung dịch Iod trên bề mặt thạch.
Đo đường kính vòng phân giải D-d mm (trừ đi đường kinh giếng).
Khảo sát tác nhân đối kháng từ môi trường nuôi cấy có tơ nấm làm chất cảm ứng
Khảo sát khả năng đối kháng của protein kết tủa từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn:
Tăng sinh vi khuẩn như mô tả trong mục 2.2.3.3 ở trên. Canh trường lên men được ly tâm 4000 vòng/phút x 15 phút. Kết tủa protein từ 20 ml dịch nổi canh trường nuôi cấy vi khuẩn với tỉ lệ ethanol: dịch ly tâm = 1:1-32:1 ở nhiệt độ 4oC, 1 giờ (làm lạnh ethanol và dịch nổi sau ly tâm trước khi kết tủa), sau đó ly tâm thu tủa ở 4000 vòng/phút x 20 phút. Kết tủa được hòa tan vào 4 ml đệm phosphate pH = 5,0)
Khảo sát khả năng đối kháng của dung dịch protein kết tủa tương tự như mô tả trong quy trình đối kháng dịch ly tâm canh trường nuôi cấy vi khuẩn, ngoài đối chứng nấm mọc trên đĩa không bổ sung dịch vào giếng thạch, còn có thêm đối chứng đệm phosphate để khảo sát ảnh hưởng của đệm phosphate lên sự phát triển nấm mốc.
52
Khảo sát hoạt tính enzyme trong protein kết tủa
Hoạt tính amylase, protease, chitinase và beta-glucanase được khảo sát bằng phương pháp khuếch tan trong giếng thạch như mô tả ở trên, trong mỗi giếng thạch bơm 0,1 ml dung dịch protein kết tủa, đối chứng được bơm đệm phosphate. Ủ 48 giờ và phát hiện vòng phân giải như mô tả ở trên.
Khảo sát khả năng đối kháng của cao ethyl acetate trích ly từ canh trường nuôi cấy VK
Tăng sinh VK như mô tả trong mục 2.2.3.3 ở trên. 20 ml canh trường lên men được ly tâm 3300 vòng/phút x 30 phút, thu dịch nổi bỏ sinh khối. Dịch nổi được ly trích bằng ethyl acetate tỷ lệ 1:1 (x 3 lần). Loại bỏ pha nước thu pha hữu cơ. Pha hữu cơ được làm khô nước với Na2SO4, lọc loại bỏ Na2SO4, sau đó cô quay loại ethyl acetate. Hòa tan cặn rắn cô quay bằng acetone, thu hồi trong eppendorf, để bay hơi acetone (13 mg), sau đó hòa tan trong 13 ml DMSO đạt nồng độ 1 mg/ ml (dịch gốc).
Pha loãng dịch chiết gốc theo tỉ lệ 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 và 1:32. Khảo sát đối kháng tiến hành như mô tả ở trên, thay dịch VK bằng dịch chiết EA.
2.2.5.4. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của VK có hoạt tính kháng nấm trong bảo quản hạt.
Sơ đồ làm màng bao bảo quản hạt đậu phộng được trình bày trên hình 2.5.
53
Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng bằng màng bao kháng nấm
Khử trùng hạt đậu phộng
Hạt đậu phộng được khử trùng bằng cồn 700 và rửa lại bằng nước cất.
Ngâm hạt trong dung dịch màng bao trong 3 giờ.
Ngâm mẫu hạt đậu phộng đã khử trùng trong 3 giờ lần lượt trong các dung dịch được chuẩn bị theo như bảng 2.1.
Bảng 2.1: Thành phần dung dịch được sử dụng để làm màng bao đậu phộng
STT Dung dịch Tỉ lệ %
1 Nước cất 100 %
2 Dung dịch chitosan 0,2 % trong acid acetic 1% 100 % 3 - Dung dịch chitosan 0,2 % trong acid acetic 1%
- DMSO
50 % 50 %
54
4 - Dung dịch chitosan 0,2 % trong acid acetic 1%
- Đệm phosphate pH =
50 % 50 % 5 - Dung dịch chitosan 0,2 % trong acid acetic 1%
- Carbendazim 0,4 %
50 % 50 % 6 - Dung dịch chitosan 0,2 % trong acid acetic 1%
- Dịch kết tủa protein
50 % 50 % 7 - Dung dịch chitosan 0,2 % trong acid acetic 1%
- Dịch kết tủa protein trong đệm phosphate
50 % 50 % 8 - Dung dịch chitosan 0,2 % trong acid acetic 1%
- Dung dịch cao ethyl acetate trong DMSO (1 mg/ml)
50 % 50 % 9 - Dung dịch chitosan 0,2 % trong acid acetic 1%
- Dịch kết tủa protein trong đệm phosphate
- Dung dịch cao ethyl acetate trong DMSO (1 mg/ml)
50 % 25 % 25 % 10 - Dung dịch chitosan 0,2 % trong acid acetic 1%
- Dịch nuôi cấy vi khuẩn chọn lọc ly tâm
50 % 50 %
Làm khô hạt
Sau đó, đậu phộng đã ngâm được làm khô ở nhiệt độ phòng và phân phối vào chai 100ml.
Cấy bào tử nấm
Bào tử nấm chỉ thị aflatroxin được chuẩn bị trước bằng cách cấy điểm 1 bào tử ở tâm đĩa petri đường kính 9 cm đổ môi trường PDA, ủ từ 3-5 ngày. Tiến hành cắt 1 miếng thạch kích thước 1x1 (cm) có chứa bào tử nấm cho vào ống nước muối sinh lý đã hấp khử trùng. Sau đó, pha loãng đến nồng độ 10-5. Hút 0.1 ml dịch pha loãng nồng độ 10-5 vào các chai 100ml chứa 12 g đậu phộng.
Lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần.
Lắc đều chai đậu phộng và ủ ở nhiệt độ phòng.
Quan sát kết quả theo thời gian 3, 5, 7, 10, 20, 30 ngày
55