CHƯƠNG II: MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Khảo sát đặc điểm của VK chọn lọc và xác định sản phẩm trao đổi chất kháng nấm
3.4.2 Xác định tác nhân đối kháng nấm mốc
3.4.2.1. Khảo sát thành phần hóa học dịch nuôi cấy, dịch kết tủa bằng cồn và cao ethyl acetate
Để xác định tác nhân đối kháng nấm mốc, canh trường sau khi loại bỏ tế bào được sử dụng dể kết tủa protein và trích ly các hợp chất khác protein bằng dung môi kị nước chủ yếu nhằm vào các hợp chất thứ cấp VK. Bằng các phương pháp định tính các hợp chất hóa học truyền thống như thuốc thử Fehling cho đường khử, thuốc thử biuret cho liên kết peptide, thuốc thử ninhydrin cho nhóm NH2- tự do, coomasie blue cho lipid, Dragendorff cho alkaloid và Salkowski cho steroid, có thể xác định được trong dịch nuôi cấy chứa đường khử, steroid, lipid, protein và amino acid, trong dịch kết tủa bằng cồn hòa tan trong đệm phosphate là protein, trong cao ethyl acetate là hợp chất có bản chất là lipid (bảng 3.7).
Bảng 3.7: Kết quả phân tích định tính các chất có trong các dung dịch trích ly
Mẫu Fehling
(đường khử)
Biuret (liên kết peptide)
Nynhy drin (nhóm -NH2 tự do)
Coomasie blue (lipid)
Dragendorf (alkaloid)
Salkowski (steroid)
Glucose +
BSA +
Tyrosine +
72
Dầu hướng
dương +
Codein +
Dexamethason +
Dịch nuôi cấy + + + + - +
Dịch kết tủa bằng cồn hòa tan trong đệm phosphate
- + - - - -
Dịch kêt tủa bằng ethyl acetate
- - - + - -
(Hình ảnh trong phụ lục B)
Như đã biết vi khuẩn hầu như không tổng hợp steroid. Tuy nhiên do môi trường nuôi cấy có bổ sung tơ nấm chứa sterol nên có phản ứng dương tính với thuốc thử Salkowski. Trong dịch nuôi cấy chứa đường khử và protein amino acid có thể còn dư từ môi trường dinh dưỡng. Tuy nhiên protein và lipid cũng có thể là sản phẩm của sinh tổng hợp của tế bào vi khuẩn. Do dịch nuôi cấy có hoạt tính enzyme như vậy chắc chắn trong dịch nuôi cấy phải có protein. Dịch kết tủa bằng cồn hòa tan trong điệm phosphate cũng dương tính với thuốc thử biuret là bằng chứng đã kết tủa được enzyme bằng cồn. Trích ly dịch nuôi cấy bằng ethyl acetate thu được lipid, tuy nhiên lipid không được bổ sung vào môi trường, vì vậy có thể cho rằng hợp chất lipid được sinh ra do vi khuẩn.
Để khảo sát hoạt tính đối kháng nấm của các thành phần thu được từ dịch nuôi cấy, dịch protein kêt tủa hòa tan trong đệm phosphate và dung dịch cao ethyl acetate hòa tan trong DMSO được khảo sát khả năng đối kháng nấm CĐP1.
3.4.2.2. Khảo sát khả năng kháng nấm của dịch protein kết tủa
73
Khi cho dịch kết tủa protein trong đệm phosphate pH = 5,0 đối kháng nấm mốc, chúng tôi nhận thấy dịch kết tủa protein có khả năng đối kháng với nấm CĐP1.
Tỉ lệ ức chế trung bình là (45,3 ± 7,6) % cho mọi tỉ lệ ethanol: dịch nuôi cấy =32:1- 1:1 sử dụng để kết tủa enzyme. Hình 3.9 cho thấy khả năng ức chế của dung dịch protein kết tủa so với đệm phosphate hẩu như không ức chế nấm mốc.
Hình 3.11: Khảo sát khả năng đối kháng nấm mốc của dịch protein kết tủa từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn CS1b, A) Đối chứng, B) Thí nghiệm, C) Đối chứng đệm
phosphate.
Như vậy ảnh hưởng của đệm phosphate lên sự phát triển nấm mốc là không đáng kể.Trong thí nghiệm, đối chứng có đệm có tỷ lệ đối kháng không đáng kể (4%) trong khi sử dụng enzyme thì đối kháng cao lên tới 45,3 %. Do đó, kết luận rằng enzyme có khả năng đối kháng với nấm CĐP1. Tuy nhiên tỷ lệ đối kháng thấp hơn so với dịch nuôi cấy, dịch nuôi cấy ly tâm và dịch nuôi cấy có chất cảm ứng ly tâm.
Để biết enzyme có như ban đầu không, kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch.
Kiểm tra hoạt tính enzyme trong dịch kết tủa protein.
Khảo sát về thành phần enzyme trong tủa protein phương pháp đĩa thạch được sử dụng. Kết quả cho thấy enzyme thu hồi được là amylase, protease, chitinase nhưng
- glucanase không phát hiện được trong kết tủa protein (hình 3.10 và bảng 3.8). Có thể đó là một lý do giải thích tại sao khả năng ức chế nấm mốc của protein kết tủa
74
thấp hơn so với dịch nuôi cấy. Do thành tế bào của nấm dạng Aspergillus app. có chứa 43% β-glucan, 19% chitin, 11% protein nên khi không trích lý được β- glucanase, khả năng đối kháng giảm đi đáng kể. Nếu thay đổi dung môi kết tủa có thể sẽ thu hồi được enzyme β-glucanase. Ngoài enzyme, có thể còn có tác nhân đối kháng khác.
Hình 3.12: Phát hiện các enzyme thu hồi bằng phương pháp kết tủa sử dụng ethanol bằng phương pháp đĩa thạch, A) Amylase, B) Protease, C) Chitinase, D) β – glucanase.
75
Bảng 3.8: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch kết tủa protein từ dịch nuôi cấy CS1b
Đĩa thạch Đường kính vòng phân giải trên đĩa thạch (D-d), mm
Tinh bột (Amylase) 12
Casein (Protease) 21
Huyền phù chitin (Chitinase)
22
-glucan (-glucanase) 0
Để tìm lời giải đáp cho tác nhân đối khác khác, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng đối kháng của cao ethyl acetate hòa tan trong DMSO.
3.4.2.3. Khảo sát khả năng đối kháng của cao ethyl acetate
Hình 3.11 cho thấy khả năng đối kháng của cao ethyl acetate trong DMSO đối với nấm mốc CĐP1. Cao ethyl acetate trong DMSO không những chỉ ức chế tăng trưởng nấm mốc (48,9±0,9) % mà còn làm mất màu bào tử. DMSO là dung môi có thể hòa tan tốt các hợp chất kị nước như lipid tuy nhiên có thể ảnh hưởng lên tăng trưởng nấm mốc. Để loại trừ tác dụng của dung môi khi khảo sát khả năng đối kháng của hoạt chất, đối chứng DMSO kháng nấm được tiến hành và cho kết quả là tỉ lệ đối kháng rất thấp (0,7±1,2) % so sánh khả năng ức chế của hoạt chất kháng nấm. Để khảo sát khả năng làm mất màu bào tử là do tác động đến cấp độ gene hay enzyme, nấm mốc từ đĩa petri sau khi bị ức chế và làm mất màu do cao ethyl acetate được cấy chuyển sáng đĩa petri mới. Nấm mốc thế hệ sau không bị ảnh hưởng (hình 3.11), như vậy cao ethyl acetate ngoài ức chế tăng trưởng có tác dụng như một chất ức chế enzyme tổng hợp sắc tố bào tử nấm mốc.
76
Hình 3.13: Khảo sát đối kháng của cao ethyl acetate đối với sự phát triển nấm mốc, A) Đối chứng không bơm dịch cao chiết, B) Mẫu thí nghiệm có bơm nhỏ dịch cao chiết trong dung môi DMSO, C) Đối chứng bơm dung môi DMSO, D) Nấm mốc cẩy chuyển từ mẫu đối chứng trong thí nghiệm đối kháng, E) Nấm mốc cẩy chuyển từ mẫu thí nghiệm trong thí nghiệm đối kháng.
Hình 3.12 là đồ thị tổng hợp khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy có tơ nấm làm chất cảm ứng, dịch kết tủa protein và cao ethyl acetate trích ly từ dịch nuôi cấy.
Từ đồ thị này có thể thấy hiệu quả ức chế của dịch nuôi cấy bổ sung tơ nấm cảm ứng (sau khi ly tâm) là do hai tác nhân đối kháng kết hợp enzyme và cao ethyl acetate có bản chất là lipid.
Để khảo sát khả năng ứng dụng sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật trong bảo quản hạt/ hạt giống và nông sản nói chung, thí nghiệm in vivo tiếp theo được tiến hành trên hạt đậu phộng cho lây nhiễm 102 bào tử CĐP1/g đậu phộng.
77
Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng nấm mốc CĐP1 của dịch nuôi cấy cảm ứng ly tâm, protein kết tủa bằng cồn trong đệm phosphate, đệm phosphate, cao ethyl acetate trong DMSO và bản thân DMSO.
3.5. Khảo sát khả năng sử dụng sản phẩm trao đổi chất chủng CS1b trong bảo quản hạt bằng phương pháp tạo màng bao
Chitosan là polymer sinh học có hoạt tính kháng vi sinh vật. Tuy nhiên với phân tử lớn > 100 kDa, khả năng kháng giảm mặc dù khả năng tạo màng lại thuận lợi hơn so với phân tử nhỏ. Thí nghiệm này nhằm thăm dò khả năng phối hợp chitosan và hoạt chất thu hồi từ CSb1 trong việc tạo màng bao kháng nấm. Thí nghiệm tương tự được Bin Zhang và cộng sự, 2009 thực hiện phối hợp chitosan 90 % deacetyl hóa hòa tan trong 1 % acetic acid kết hợp với chất ức chế enzyme trypsin từ đậu nành có khả năng ngăn ngừa bào từ Aspergillus flavus nảy mầm khi cảm nhiễm đậu phộng với mật độ 102 bào tử/g ).
Trong thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm CĐP1 của chitosan thương mại là gần 40 % khi hòa tan 0,2 % vào 1 % acetic acid. Từ đó chitosan 0,2 % trong acid acetic 1 % được sử dụng để làm màng bao hạt đậu phộng. Theo dõi sự mọc của
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0
I % dịch nuôi cấy cảm ứng ly tâm I % protein I % đệm phosphate I % cao EA I % DMSO
Tỉ lệ ức chế, %
78
nấm CĐP1 cảm nhiễm với 102 bào từ /g đậu phộng và các vi sinh vật khác nhiễm từ
môi trường cho kết quả như trình bày trên bảng 3.9 và hình 3.13.
Bảng 3.9: Khả năng ức chế nấm mốc và vi khuẩn phát triển trên hạt đậu phộng được bao màng chitosan và sản phẩm trao đổi chất CS1b
STT Dung dịch 0 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 10 ngày
30 ngày
1 Nước cất - - + ++ +++ +++
2 Chitosan 0,2 % - - + ++ +++ +++
3 Chitosan 0,2 % +
DMSO - - + ++ +++ +++
4 Chitosan 0,2 % +
Đệm phosphate - - + ++ +++ +++
5 Chitosan 0,2 % + Carbendazim 0,4
%
- - - * * *, +
6 Chitosan 0,2 % +
protein kết tủa - + ++ +++ +++ +++
7 Chitosan 0,2 % + cao ethyl acetate trong DMSO (1 mg/ml)
- - - -
8 Chitosan 0,2 % + protein kết tủa + cao ethyl acetate trong DMSO (1 mg/ml)
- - - - * *
79
9 Chitosan 0,2 % + Dịch nuôi cấy ly tâm
- +++ +++ +++ +++ +++
(-: không nhiễm; + nhiễm nấm mốc ít, ++ nhiễm mốc trung bình, +++ nhiễm mốc nhiều ; * nhiễm khuẩn).
Sau khi được khử trùng bề mặt bằng ethanol 70o, hạt đậu phộng được ngâm trong dung dịch tạo màng bao gồm chitosan và các sản phẩm trao đổi chất của tế bào CS1b. Bốn đối chứng âm gồm nước cất, đối chứng chitosan (0,2 % trong 1 % acetic acid), đối chứng DMSO (chitosan + DMSO), đối chứng đệm phosphate (chitosan + đệm phosphate) và đối chứng dương là chitosan + carbendazim 0,4 %. Các mẫu thí nghiệm bao gồm chitosan + dung dịch protein kết tủa bằng cồn hòa tan trong đệm phosphate, chitosan + cao ethyl acetate trong DMSO, chitosan + dung dịch protein kết tủa bằng cồn hòa tan trong đệm phosphate + DMSO và cuối cùng là chitosan + dịch nuôi cấy với tơ nấm cảm ứng ly tâm. Sau 30 ngày theo dõi sự xuất hiện của nấm mốc và vi khuẩn kết quả được trình bày trên bảng 3.9 và hình 3.11. Do trong các mẫu đều cấy 102 bào tử CĐP1/ g đậu phộng và hạt đậu phộng sau khi ngâm trong dung dịch chitosan chỉ làm khô trong không khí nên nấm mốc rất dễ phát triển. Tất cả các mẫu đối chứng âm đều mọc nấm rõ rệt sau 5 ngày. Nấm mốc phát triển trên các mẫu này không chỉ là mốc xanh (CĐP1) mà còn nhiều loài nấm khác nhìn thấy rõ qua màu trắng, đen và xám. Trong khi đó mẫu thí nghiệm màng bao chitosan + dịch nuôi cấy ly tâm, mốc xanh mọc nhanh nhất, mới sau 3 ngày đã phủ kín hạt đậu phộng; kế đến mẫu thí nghiệm màng bao chitosan + protein kết tủa cũng bắt đầu mọc nấm sau 3 ngày. Ở mẫu thí nghiệm chitosan + cao ethyl acetate không thấy mọc nấm sau 30 ngày ở cả ba lần lặp lại. Trong khi đó mẫu đối chứng dương chitosan + carbendazim 0,4 %, nhiễm khuẩn bắt đầu từ 7 ngày và nhiễm nấm bắt đầu sau 30 ngày. Ngược lại với mong đợi, khi kết hợp chitosan + cao ethyl acetate và protein kết tủa, tác dụng bảo vệ không mạnh hơn mà lại yếu hơn trường hợp chỉ có chitosan và cao ethyl acetate. Khi thực hiện đối kháng in vitro, cao ethyl acetate chỉ ức chế được khoảng 50 % tăng trưởng nấm CĐP1, protein kết tủa 45 %, dịch nuôi cấy ly tâm ức chế cao
80
nhất tới 60 % tăng trưởng nấm mốc. Trong thí nghiệm đối kháng in vivo (màng bao đậu phộng kết hợp chitosan) thì chỉ cao ethyl acetate có tác dụng. Protein dễ dàng trở thành dinh dưỡng cho nấm mốc. Khi có cả cao ethyl acetate và protein nấm mốc bị ức chế nhưng không ức chế được vi khuẩn sau 10 ngày. Khi sử dụng dịch nuôi cấy ly tâm, ngoài protein và cao ethyl acetate còn có thành phần dinh dưỡng khác còn dư trong môi trường, do đó tạo điều kiện cho nấm mốc CĐP1 cấy vào nhanh chóng nảy mầm và phát triển.
Từ kết quả trên có thể thấy cao ethyl acetate từ dịch nuôi cấy CS1b có bản chất là lipid và có khả năng ức chế nấm mốc CĐP1 in vitro và in vivo. Kết quả này phù hợp với nhiều báo cáo về hợp chất thứ cấp như polypeptide, biosurfactant từ chi Bacillus có hoạt tính kháng nấm (Sanket Joshi và cộng sự, 2008).
81
Hình 3.15: Theo dõi quá trình phát triển của nấm mốc và vi khuẩn trên hạt đậu phộng đã được bao gói bằng chitosan kết hợp các sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật. Kết quả coating đậu phộng ngày thứ 10. A) Đối chứng đậu phộng. B) Đối chứng chitosan. C) Đối chứng DMSO. D) Đối chứng đệm phosphate. E) Đối chứng carbenazim. F) Thí nghiệm dịch protein kết tủa. G) Thí nghiệm cao EA. H) Thí nghiệm dịch protein kết tủa + cao EA, I) Thí nghiệm dịch nuôi cấy có bổ sung tơ nấm ly tâm.
82