CHƯƠNG II: MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phân lập nấm sinh aflatoxin từ sản phẩm nông nghiệp
3.1.1 Phân lập nấm từ sản phẩm nông nghiệp và khảo sát đặc điểm hình thái Từ các mẫu nông sản khác nhau như hạt đậu phộng, hạt đậu nành, hạt cà phê bị hư, hỏng, thối rữa, được rửa sạch bằng nước cất để loại bỏ cát, bụi. Tiến hành nuôi cấy mẫu trong môi trường WA (Water agar) từ 3 – 5 ngày. Nấm trên hạt mẫu phát triển trên môi trường WA (hình 3.1).
Hình 3.1: Mẫu hạt nuôi cấy trên môi trường WA. A) Hạt đậu phộng, B) Hạt đậu nành, C) Hạt cà phê.
Bào tử nấm mọc trên môi trường WA được cấy chuyền sang môi trường PDA để phân lập chủng thuần khiết. Sau khi ủ 3 ngày, 7 chủng nấm thuần được phân lập và đặt tên là: X3, CĐP1, CĐP2, CĐP3 trên hạt đậu phộng, ĐN1, ĐN2, ĐN3 trên hạt đậu nành và HCP2 trên hạt cà phê.
Hình thái nấm mốc được quan sát trên môi trường PDA như sau: các chủng X3, CĐP1, CĐP2, CĐP3, ĐN1, ĐN2, và HCP2 đều lên tơ trắng và bào tử màu xanh lục, ở đỉnh các cuống bào tử đính mọc thẳng đứng, có vách sần sùi, đầu mang bào tử đính có dạng hình thuôn dài. Riêng chủng ĐN3 có bào tử màu đen, bông hình cầu, vách cuống trơn và bào tử đính có dạng hình cầu. Khảo sát hình thái tế bào khi nuôi cấy bằng phương pháp phòng ẩm cho thấy các chủng CĐP1, CĐP2, CĐP3, ĐN1, ĐN2 và HCP1 thuộc nhóm Asp. flavus và ĐN3 nghi ngờ thuộc loài Asp. niger.
56
A)
B)
C)
D)
E)
57
F)
G)
H)
Hình 3.2: Các chủng nấm phân lập A) Chủng CĐP1, B) CĐP2, C) CĐP3 D) ĐN1, E) ĐN2, F) ĐN3, G) HCP2, H) X3 lần lượt theo hàng ngang: khuẩn lạc trên PDA, nuôi cấy phòng ẩm (X1000), khuẩn lạc trên AFPA agar mặt trên và mặt dưới.
3.1.2 Khảo sát hình thái nấm phân lập trên môi trường phân biệt AFPA
Cấy chuyển các chủng nấm sang môi trường AFPA (Aspergillus flavus and aspergillus paraciticus agar) bằng phương pháp cấy điểm. Môi trường AFPA là môi trường phân biệt nhóm Asp. flavus dựa trên đặc tính chuyển hóa màu môi trường ở mặt sau đĩa thạch sang màu vàng cam do môi trường này chứa muối sắt III, do đó khi gặp aspergillic acid sinh ra do Aspergillus flavus và Aspergilus parasiticus chuyển màu cam đỏ, còn Asp. niger chuyển màu vàng (Assante et al, 1981, Pitt et al. 1983).
58
Tất cả các chủng phân lập được bao gồm X3, CĐP1, CĐP2, CĐP3 từ hạt đậu phộng, ĐN1 và ĐN2 từ hạt đậu nành và HCP2 từ hạt cà phê khi cấy trên môi trường AFPA đều chuyển hóa màu môi trường ở mặt sau đĩa thạch sang màu cam đỏ, còn ĐN3 chuyển sang màu vàng (hình 3.2).
Từ đó có thể kết luận các chủng phân lập được đều thuộc chi Aspergillus, trong đó các chủng X3, CĐP1, CĐP2, CĐP3, ĐN1, ĐN2 và HCP1 thuộc nhóm Asp. flavus, Asp. parasiticus và ĐN3 nghi ngờ thuộc loài Asp. niger.
3.1.3 Khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các chủng nấm phân lập
Để khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các chủng nấm phân lập, phương pháp nuôi cấy trên môi trường Czapek biến đổi có bổ sung cơ chất từ nguồn phân lập, đó là Czapek liquid peanut, Czapek liquid coffee, Gzapek liquid soy bean (Ling và cộng sự, 1967). Dịch trích ly sau khi cô quay đến khô được hòa tan trong chloroform và phân tích bằng phương pháp sắc ký bản mỏng trong hệ dung môi chloroform:methanol (95:5). Sau khi phát triển sắc ký và sấy khô, các vệt được phát hiện bằng tia UV 254 nm. Vệt nào phát huỳnh quang được coi là aflatoxin. Kết quả trên hình 3.3 cho thấy nấm CĐP1 phát huỳnh quang mạnh nhất, sau đó là CĐP2 và ĐN3, CĐP3, ĐN1, ĐN2, HCP2. Trong khi đó nấm X3 không phát huỳnh quang, được giải thích là không sinh aflatoxin.
59
Hình 3.3: Kết quả chạy sắc ký bản mỏng (TLC) của các chủng vi nấm phân lập phát hiện phát huỳnh quang khi chiếu tia UV 254 nm, 1- ĐC, 2- HCP2, 3-CĐP1, 4- CĐP2, 5- CĐP3, 6-ĐN1, 7- ĐN2 và 8- ĐN3.
Bảng 3.1: Khả năng sinh aflatoxin của các nấm mốc phân lập trên sản phẩm nông nghiệp.
Nấm CĐP1 CĐP2 ĐN3 CĐP3 ĐN1 ĐN2 HCP2 X3 Đánh
giá
+++ ++ ++ + + + + -
Chú thích: (-): không phát quang; (+): phát quang yếu; (++): phát quang trung bình, (+++): phát quang mạnh.
Nấm mốc CĐP1 phát quang mạnh nhất trong số các chủng phân lập, do đó mẫu trích ly từ nuôi cấy nấm mốc này cũng được đưa đi kiểm tra bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC/MS) có chuẩn là aflatoxin tinh khiết.
60
3.1.4 Định tính aflatoxin bằng phương pháp HPLC
Kiểm tra mẫu trích ly từ nuôi cấy CĐP1 bằng phương pháp HPLC sử dụng chuẩn AFG1, AFG2, AFB1, AFB2 cho thấy thành phần chính trong hỗn hợp aflatoxin từ CĐP1 là AFB1, dạng aflatoxin có độc tố lớn nhất trong số các aflatoxin.
Hình 3.4: Kết quả định tính aflatoxin bằng phương pháp HPLC.
3.1.5 Khẳng định khả năng sinh aflatoxin của các chủng nấm mốc bằng phương pháp tái nhiễm trên hạt đậu phộng, hạt đậu nành và hạt café
Để khẳng định các nấm phân lập đều sinh aflatoxin, bào tử của chúng được tái nhiễm vào các nguồn mẫu phân lập (Ting Zhang và cộng sự, 2007). Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng khoảng từ 3 – 5 ngày cho đến khi các chủng nấm mọc đều các hạt mẫu và kín đều dưới đáy chai, lật ngược đáy chai và đem soi dưới tia UV ở bước sóng 254nm.
Sự xuất hiện vệt phát quang màu xanh dưới đáy chai được coi là có sinh aflatoxin.
Dựa vào kết quả của TLC, X3 không cho vệt phát quang ở bước sóng 254nm. So với X3, các chủng nấm CĐP1, CĐP2, CĐP3 từ hạt đậu phộng, ĐN1, ĐN2, ĐN3 từ hạt đậu nành đều có sự xuất hiện vệt phát quang màu xanh dưới đáy chai. Riêng HCP2 trên hạt cà phê không có sự xuất hiện vệt phát quang màu xanh dưới đáy chai (xem phụ lục B).
61
Hình 3.5: Kết quả khẳng định khả năng sinh tính aflatoxin bằng phương pháp tái nhiễm. A) có sự xuất hiện vệt phát quang màu xanh rõ rệt. B) không có sự xuất hiện vệt phát quang màu xanh.
Từ các kết quả định tính aflatoxin bằng phương pháp TLC, HPLC và tái nhiễm, rút ra kết luận rằng:
o Nấm X3 không sinh aflatoxin.
o Nấm CĐP1, CĐP2, CĐP3, ĐN1, ĐN2, ĐN3 và HCP2 có sinh aflatoxin.
o Trong đó, nấm CĐP1 cho vệt phát quang trong TLC rõ nhất và phát quang mạnh trong tái nhiễm, chọn nấm CĐP1 là chủng nấm sinh aflatoxin mạnh nhất trong 7 chủng nấm đã phân lập được là nấm chỉ thị sinh aflatoxin trong thí nghiệm kháng nấm về sau.
o Để thực hiện việc tuyển chọn chủng VK mạnh nhất đối kháng với chủng nấm sinh aflatoxin mạnh nhất, tức là chủng nấm CĐP1 đã chọn, tiến hành thử đối kháng các chủng VK với các chủng nấm bằng phương pháp đồng nuôi cấy. Sau đó, chọn chủng VK mạnh nhất, đối kháng được với nhiều chủng nấm nhất và cuối cùng, thử đối kháng chủng VK mạnh nhất này với nấm CĐP1.