1.3. Các phương pháp phát hiện Aflatoxin
1.3.2. Phát hiện bằng đường lý - hoá học
Ta có thể nhận biết sự có mặt aflatoxin một cách dễ dàng nhờ một số tính chất của chúng:
− Khử nitrat bạc ammoniac, molipdat và natri tungstate.
− Trong môi trường pecloric, tạo với cacbonzon thành hợp chất cộng có màu tím đặc trưng, cũng chức năng này phản ứng yếu với vanilin trong môi trường xút 38%.
− Ngưng tụ với phenol trong môi trường sunfuric và acid sunfuric cũng có vết hình dẻ quạt.
− Dễ bị phân hủy trong môi trường kiềm.
− Phản ứng với di-O-anizidin-tetrazolium clorua để tạo thành các hợp chất xanh – tím với các aflatoxin B1, B2 và nâu với aflatoxin G2.
1.3.2.1. Chiết xuất và tinh chế nước chiết
33
Phần lớn các phương pháp chiết xuất và tinh chế đều dựa trên tính chất các aflatoxin tan trong một số dung môi hữu cơ như cloroform, metanol, etanol, axeton, benzen…và không tan trong một số dung môi béo như hexan, ete dầu hỏa, ete etylic.
1.3.2.2. Tách bằng sắc ký
❖ Sắc ký giấy
Việc tách bằng phương pháp sắc ký đầu tiên được thực hiện trên sắc ký giấy và triển khai bằng hệ thống benzen: toluen: xiclohexan: ethanol: nước. Các phương pháp được khuyên dùng là những phương pháp cổ điển, dùng 2 hệ thống dung môi:
− Hệ thống 1 gồm butanol: axit acetic: nước (20: 19: 1)
− Hệ thống 2 gồm cloroform: methanol (95: 5)
Với hệ thống 1, việc làm bão hòa thùng sắc ký với pha ướt và triển khai thực hiện với pha trên ở nhiệt độ 240C. Sắc ký chạy kéo dài 20 giờ trên băng giấy Whatmann số 1, kích thước 550 x 30 mm. Vết sắc ký ở cách gốc băng giấy 60 mm, cách tầm dung môi bắt đầu lan 30 mm.
Với dung môi 2, việc làm bão hòa và chạy sắc ký thực hiện với cùng 1 pha và lần lượt kéo dài 1 giờ và 3 giờ 30 phút. Hệ thống dung môi này được sử dụng nhiều.
Dù là dung môi nào, người ta cũng sấy ở 1000C trong vòng 20 phút.
❖ Sắc ký cột: loại sắc ký này thường được sử dụng. Tùy theo trường hợp mà người ta dùng:
− Cột alumin− Cột gel silic với chất tách là cloroform và 5% hỗn hợp methanol- cloroform.
− Cột axit silixic với chất tách là hỗn hợp cloroform: ethanol (99: 1).
− Cột xenluloza với chất tách là hỗn hợp hexan: cloroform (1: 1).
❖ Sắc ký lớp mỏng:
- Phương pháp sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960. Người ta sử dụng các bản mỏng được tráng bởi silicagel để xác định aflatoxin. Đây là phương pháp được dùng thường xuyên nhất.
Có thể triển khai trong nhiều hỗn hợp khác nhau, thông thường nhất là:
34
− Cloroform: methanol (99: 1), (98: 2), (97: 3), (95: 5), (93:7)
− Cloroform: axeton (90: 10), (85: 15)
− Cloroform: axeton: ethanol (89: 10: 1)
− Cloroform: axeton: 2-propanol (850: 125: 25), (825: 150: 25)
− Methanol: nước: ete (3: 1: 96)
− Benzen: ethanol: nước (46: 35: 19)
−Nước: aceton: chloroform (1.5:12:88)
- Thời gian triển khai thay đổi từ 45 phút hay 2 đến 3 giờ. Người ta thường khuyên nên hoạt hóa bằng nhiệt vì việc chuyển dịch dung môi ở nhiệt độ thấp chậm hơn. Rõ ràng là Rf của các aflatoxin khác nhau biến đổi tùy theo điều kiện làm sắc ký. Đối với sắc ký lớp mỏng, người ta thường dùng alumin, bột xenluloza hoặc gel poliamit làm giá.
- Một điểm rất quan trọng nữa là các lớp mỏng phải thật sự bão hòa trước trong bình, nơi sắc ký sẽ triển khai. Sự bão hòa này phải đủ lâu để được hoàn toàn, nhưng không được kéo dài quá vì có thể gây ra những nhiễu loạn quan trọng trong việc chuyển dịch các thành phần cấu tạo của các mẫu.
- Giá đỡ sắc ký thường là những tấm kính 200 x 200 mm, nhưng những phương pháp đơn giản hóa khuyên dùng những phiến kính thường để làm tiêu bản hiển vi (26 x 76 mm) hay những giá đỡ mềm như tấm phim. Khi làm sắc ký, một số hợp chất có thể tương tự aflatoxin; để tránh xác định nhầm, nên sử dụng một hệ thống 2 chiều. Hệ thống này giúp dễ thấy sự khác biệt giữa các aflatoxin B1 và G1 (do có trị số Rf thường rất gần nhau).
- Hệ dung môi gồm nước: aceton: chloroform (1.5:12:88 v/v) được đánh giá có khả năng hòa tan aflatoxin tốt nhất. Các bản mỏng sau khi phát triển sắc ký được đưa vào bởi đèn tử ngoại (UV) 365mm. Các vết mẫu phân tích tạo màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây. Và có độ dài Rf được so sánh với các vết của aflatoxin tiêu chuẩn. Phương pháp này có thể được xác định lượng từ (3 – 4).10-4 microgram (0.3 – 0.4mg).
- Nhược điểm của phương pháp là phụ thuộc vào người phân tích. Khi so sánh giữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả từ 20-30%.
35
- Hội hóa học phân tích (A.O.A.C-1980) đã lưu ý tới phương pháp phân tích định lượng sử dụng TLC. Phương pháp này được mở rộng thành chương trình phân tích mẫu của tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới. Các kết quả của chương trình phân tích trên đã chứng nhận sự chính xác của phân tích bằng TLC vì sai số rất cao.
Khẳng định sự có mặt của aflatoxin
- Một số chất được tách ra từ mẫu đôi khi dễ nhầm lẫn với aflatoxin, dẫn đến sự khẳng định sai lệch. Phương pháp khẳng định sự có mặt của aflatoxin trực tiếp thực hiện trên bản sắc kí. Dựa vào sự biến đổi của aflatoxin thành các đồng phân có màu huỳnh quang khác so với huỳnh quang ban đầu, cả aflatoxin chuẩn và aflatoxin có trong mẫu phân tích đều chuyển sang cùng một đồng phân.
- Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin trong mẫu phân tích được phát hiện bởi Przybylski(1975) và được hội phân tích hóa học Hoa Kì (A.O.A.C) công nhận.
- Aflatoxin B1 được acid hóa để trở thành đồng phân aflatoxin B2a. Đồng phân này có nàu huỳnh quang màu xanh và có độ dài Rf thấp hơn so với độ dài Rf của aflatoxin B1. Theo phương pháp của Przybylski, aflatoxin B1 được chuyển thành aflatoxin B2a nhờ acid Trifluoracetic (TFA) phun trực tiếp lên các bản mỏng trước khi chạy trong dung môi chạy.
- Acid sufuric làm thay đổi màu huỳnh quang xanh da trời của aflatoxin B1 thành màu vàng. Thử nghiệm này nhằm khẳng định sự không có mặt của aflatoxin nếu vết nghi ngờ không chuyển thành màu vàng.