CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.5. Các loại môi trường
Môi trường phân lập, nuôi cấy và xác định khả năng đối kháng của nấm Trichoderma: Môi trường Potato D-Glucose agar (PDA)
- Thành phần môi trường:
+ D – Glucose 20g
+ Agar 20g
+ Dịch chiết khoai tây 1000ml
* 200g khoai tây gọt vỏ, rữa sạch cắt nhỏ cho vào bếp đun với 1 lít nước từ 15 – 20 phút, sau đó lọc lấy dịch trong.
Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm Phytophthora palmivora: Môi trường Cornmeal agar (CMA)
- Thành phần môi trường:
+ Bột bắp (cornmeal) 20g
+ D – Glucose 20g
+ Pepton 20g
+ Agar 15g
* Phối 20g cornmeal vào cốc thủy tinh sau đó thêm 500ml nước cất, đun và khuấy đều hỗn hợp ở 60oC trong 1 giờ. Sau đó thêm glucose, pepton và agar vào và đem hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong vòng 15 phút.
Môi trường khảo sát hoạt tính sinh enzyme ngoại bào: Môi trường Minimal Synthetic Medium (MSM)
- Thành phần môi trường:
+ Cơ chất 10g
+ MgSO4.7H2O 0,2g
+ K2HPO4 0,9g
+ KCl 0,2g
+ NH4NO3 1g
+ FeSO4.7H2O 0,002g
+ MnSO4 0,002g
+ ZnSO4 0,002g
- 36 -
+ Agar 20g
* Cơ chất để khảo sát hoạt tính enzyme chitinase và cellulase lần lượt là huyền phù chitin 1% và CMC.
- 37 - 2.3. Phương pháp nghiên cứu.
2.3.1. Phương pháp phân lập nấm gây bệnh thối trái trên cacao.
2.3.1.1. Phân lập từ mẫu trái cacao nhiễm bệnh thối trái.
Tiến hành theo phương pháp của Canten và Jinks (1986)
Các bước thu mẫu
Chuẩn bị mẫu bệnh: các mẫu bệnh thu tại vườn cacao, chọn những mẫu bệnh điển hình, mới, còn tươi, không dính thuốc bảo vệ thực vật và tốt nhất nên chọn những trái cacao thuộc các giống mẫn cảm với bệnh. Quả cacao thu về được phân lập ngay.
Các bước phân lập, cấy truyền và làm thuần mẫu nấm bệnh.
a) Khử trùng mẫu: Rửa mẫu bệnh bằng nước để loại bỏ bụi bẩn. Sau đó mới khử trùng mẫu bệnh. Quá trình khử trùng bề mặt phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm của mô bệnh. Một trong những phương pháp phổ biến nhất là có thể khử trùng bằng cồn 70% trong vòng 1 phút.
c) Chuẩn bị mẫu cấy: Dùng dao vô trùng cắt một mẫu vỏ trái nhỏ (1-2 x 1-2mm) nơi tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe. Dùng kẹp đã khử trùng gấp giữ và ấn nhẹ những mẫu cấy lên mặt thạch gần mép đĩa môi trường phân lập CMA. Đặt ngược đĩa cấy để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường ở nhiệt độ phòng.
d) Ủ mẫu cấy và theo dõi: Đặt mẫu sau khi cấy ở điều kiện nhiệt độ phòng và chiếu sáng 12h luân phiên.
Kiểm tra đĩa cấy hàng ngày, khi quan sát thấy xung quanh mẫu cấy xuất hiện sợi nấm, tiến hành dùng que cấy khêu nhẹ sợi nấm và cấy lên môi trường CMA. Sau k \hi chuyển nấm lên môi trường 3 – 4 ngày kiểm tra xem sợi nấm có phát triển tốt hay không, nấm đã thuần chưa. Nếu mẫu đã thuân có thể tiến hành cấy chuyển sau 7 – 9 ngày nuôi cấy.
Các thao tác đều được tiến hành trong tủ cấy vi sinh dưới ngọn lửa đèn cồn.
- 38 - e) Tính tỷ lệ xuất hiện của nấm ở các mẫu cấy:
Trong đó: A là số mẫu cacao xuất hiện nấm.
B là tổng số mẫu phân lập.
2.3.2. Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm.
2.3.2.1. Quan sát đại thể nấm sợi
Tiến hành theo phương pháp của Agrios (2005)
Quan sát hình thái đại thể các chủng nấm đối kháng cũng như nấm bệnh bằng việc mô tả đặc điểm tản nấm của chúng khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng.
Các chủng nấm phân lập được sẽ được cấy điểm trên tâm đĩa môi trường CMA và được ủ 1 tuần.
Quan sát mô tả các đặc điểm: Kích thước tản nấm để biết tốc độ phát triển;
Dạng sợi nấm, màu sắc tản nấm mặt trước và mặt sau; Màu sắc của môi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra; thời gian hình thành động bào tử trong thời gian nuôi ủ; khả năng tạo túi bào tử trên khi nuôi cấy trên môi trường agar.
2.3.2.2. Quan sát vi thể nấm.
a) Quan sát sợi nấm Phytophthora.
Tiến hành theo phương pháp của Agrios (2005)
Quan sát hình thái vi thể các chủng nấm phân lập được bằng phương pháp tiêu bản phòng ẩm.
Chuẩn bị một đĩa môi trường CMA và một đĩa petri vô trùng nuôi cấy chứa:
Tỷ lệ (%) = A/B x 100
Hình 2. 1: Quy trinh phân lập nấm bệnh từ mẫu thực vật nhiễm bệnh
- 39 -
mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle đặt lên trên hai thanh đũa tre.
Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1 cm2) từ đĩa môi trường CMA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy. Dùng dây cấy đã khử trùng, lấy sinh khối nấm thí nghiệm cấy vào 4 mặt bên của khối thạch.Sau đó đậy lamelle lên trên khối thạch. Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm trong đĩa. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử xảy ra (thường là 4 – 5 ngày).
Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên một lame sạch có sẵn một giọt Methylene blue. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần và mô tả đặc điểm: Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn; Hình dạng cuống bào tử; Đặc điểm hình dạng. màu sắc, kích thước bào tử…
b) Tạo động bào tử Phytophthora
Tiến hành theo phương pháp của Drenth và Sedall (2001)
Một số loài Phytophthora tạo túi bào tử (Sporangia) dễ dàng trên môi trường agar trong khi số khác chỉ tạo được túi bào tử trong môi trường lỏng như nước cất, dung dịch muối khoáng hay dịch chiết suất thích hợp. (Schmitthenner và Bhat, 1994)
Chủng nấm nghi ngờ Phytophthora được nuôi cấy trên môi trường CMA trong 2 – 4 ngày. Cắt 1 khoanh thạch có chứa khuẩn lạc nấm bệnh đường kính 0.5 cm cho vào đĩa petri có sẵn nước cất và 1 mảnh giấy lọc đã được hấp vô trùng từ trước.
Nuôi cấy trong điều kiện có ánh sáng liên tục và đặt trong nhiệt độ phòng. Túi bào tử sẽ nãy mầm và phóng thích ra các bào tử động (Zoospores) trong khoảng thời gian từ 1 – 2 ngày. Quan sát dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại từ 40X nhằm sát định du động bào tử.
2.3.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch.
Nguyên tắc: Để thực hiện quá trình lây bệnh nhân tạo, các trái cacao chọn làm thí nghiệm phải sạch bệnh, được lấy từ những vườn chưa có dấu hiệu nhiễm bệnh
- 40 -
thối trái và cùng một giống cacao với trái dùng để phân lập nấm bệnh. Bệnh có thể được tái tạo bằng cách cấy tác nhân gây bệnh theo cơ chế xâm nhiễm của tác nhân đó. Chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh được thí nghiệm. Luôn luôn bố trí công thức đối chứng (bao gồm các cây không được lây bệnh). (Agrios, 2005)
Tiến hành:
Tiến hành theo phương pháp của Lê Cao Lượng (2004)
Lây bệnh nhân tạo từ trái cacao
Sử dụng mẫu nấm thuần mới phân lập được làm tác nhân gây bệnh, Lây bệnh bằng cách cho động bào tử xâm nhiễm vào trái cacao khỏe, không nhiễm bệnh.
Chuẩn bị dịch có chứa động bào tử gây bệnh: Đĩa petri chứa nấm nghi ngờ nấm bệnh được nuôi cấy trong vòng 7 ngày trên môi trường CMA. Hút một ít nước cất vô trùng cho vào đĩa trên sao cho nước chỉ đủ trãi đều khắp bề mặt thạch mà không tràn ra khỏi đĩa, dùng que cấy trang vô trùng cạo nhẹ và đều khắp bề mặt thạch nhằm lấy các túi bào tử và tơ nấm. Đậy đĩa petri lại và dùng paraffin quấn kín, ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 – 2 ngày.
Dùng giấy thấm, cắt thành những hình tròn bán kính 0.5cm, hấp vô trùng. Sau khi các mẫu giấy nguội, dùng kẹp vô trùng kẹp từng mảnh giấy cho vào dịch chứa động bào tử đã chuẩn bị phía trên và để trong khoảng 1 giờ.
Dùng dao mỗ vô trùng tạo vết thương nhỏ khoảng 0.2 cm trên trái cacao sạch bệnh nhằm tạo điều kiện dễ dàng cho nấm bệnh xâm nhập vào trái. Dùng kẹp vô trùng kẹp từng mãnh giấy đã thấm dịch chứa du dộng bào tử chuẩn bị phía trên đặt lên vị trí vết thương vừa tạo. Cho mẫu trái cacao vừa lây nhiễm bệnh nhân tạo này vào túi nhựa đã hấp vô trùng buộc kín bên trong có giấy thấm nước vô trùng nhằm duy trì độ ẩm trong bao.
Mẫu thí nghiệm gồm 5 trái cacao sạch bệnh được lây nhiễm nhân tạo từ cùng 1 chủng nấm nghi ngờ nấm bệnh phân lập được. Mẫu đối chứng gồm 5 trái cacao sạch bệnh nhưng không được lây nhiễm nấm bệnh, những khoanh giấy thấm hình tròn chỉ được thấm nước cất vô trùng.
Đặt các trái cacao thí nghiệm và đối chứng trong cùng điều kiện nhiệt độ phòng
- 41 -
với điều kiện sáng và tối xen kẽ để hoàn thành quá trình lây bệnh.
Thời gian theo dõi: 5, 10, 15 ngày sau khi lây nhiễm.
Kiểm tra và so sánh những tai nấm được lây bệnh với những tai nấm đối chứng.
Quan sát và ghi nhận các triệu chứng và so sánh các triệu chứng biểu hiện khi lây bệnh nhân tạo với các triệu chứng bệnh ban đầu.
Tỷ lệ xuất hiện bệnh (%) sau khi lây bệnh nhân tạo tính theo công thức:
Trong đó: A là số mẫu bị nhiễm bệnh.
B là tổng số mẫu lây nhiễm.
Kiểm chứng tác nhân gây bệnh
Các trái cacao thí nghiệm sau khi lây bệnh có biểu hiện bệnh giống tương tự như quan sát lúc ban đầu trước khi phân lập được phân lập lại nhằm khẳng định tác nhân gây bệnh.
Phân lập lại từ các trái mới bị bệnh. Tiến hành quan sát kiểm tra và đối chiếu hình thái đại thể và vi thể của chúng. Mẫu nấm phân lập lại có đặc điểm hình thái phải giống như mẫu nấm được làm thuần ban đầu.
2.3.4. Phương pháp phân lập nấm đối kháng Trichoderma spp 2.3.4.1. Các bước thu mẫu
- Chọn đất có nhiều mùn hoặc xác bã thực vật hoặc đất gần gốc, rễ của cây bị bệnh (không có xử lý thuốc trừ nấm).
- Mỗi vùng lấy 5 mẫu, mỗi mẫu 100g đem về và trộn đều.
2.3.4.2. Các bước phân lập.
- Cân 10 g đất vào 90 ml cất đã khử trùng, lắc đều mẫu trong khoảng 20 phút - Chuẩn bị 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước cất và được đánh số từ 1 đến 4.
- Dùng micropipette hút 1ml dung dịch đất trong bình tam giác, cho vào ống nghiệm thứ 1, lắc đều.
- Hút 1ml từ dung dịch ở ống nghiệm thứ 1 cho vào ống nghiệm thứ 2, lắc đều.
- Hút 1ml dung dịch ở ống nghiệm thứ 2 cho vào ống nghiệm thứ 3, lắc đều.
- Từ ống nghiệm thứ 3 hút 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm thứ 4, lắc đều.
Tần lệ xuất hiện = A/B x 100
- 42 -
Hình 2. 2: Phương pháp pha loãng dung dịch đất.
- Sau khi lắc kỹ, dựng micropipet hỳt 100 àl (1/10 ml) dung dịch của cỏc nồng độ pha loãng trên rồi nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường đã chuẩn bị. Dùng que cấy vô trùng trang đều dung dịch trên bề mặt thạch, đậy kín nắp hộp và đánh dấu nồng độ lên nắp. Đặt úp nắp hộp xuống dưới để tránh đọng nước. Mỗi nồng độ làm 3 đĩa lặp lại.
2.3.4.3. Cấy truyền và làm thuần mẫu nấm Trichoderma.
- Kiểm tra đĩa cấy hàng ngày, khi các tản nấm phát triển từ những đĩa cấy, dùng que cấy đã khử trùng cấy truyền bằng cách cấy đỉnh đầu sợi nấm sang đĩa môi trường PDA để tách rời các chủng nấm.
- Tiến hành làm thuần các mẫu nấm qua nhiều lần cấy truyền.
2.3.5. Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm.
2.3.5.1. Quan sát đại thể nấm sợi.
Quan sát hình thái đại thể các chủng nấm đối kháng cũng như nấm bệnh bằng việc mô tả đặc điểm tản nấm của chúng khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng.
Các chủng nấm phân lập được sẽ được cấy điểm trên tâm đĩa môi trường PDA và được ủ 1 tuần.
Quan sát mô tả các đặc điểm: Kích thước tản nấm để biết tốc độ phát triển;
Dạng sợi nấm, màu sắc tản nấm mặt trước và mặt sau; Màu sắc của môi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra.
- 43 - 2.3.5.2. Quan sát vi thể nấm.
a) Quan sát sợi nấm Trichoderma.
Quan sát hình thái vi thể các chủng nấm phân lập được bằng phương pháp tiêu bản phòng ẩm.
Chuẩn bị một đĩa môi trường PDA và một đĩa petri vô trùng nuôi cấy chứa:
mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle đặt lên trên hai thanh đũa tre.
Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1 cm2) từ đĩa môi trường PDA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy. Dùng dây cấy đã khử trùng, lấy sinh khối nấm thí nghiệm cấy vào 4 mặt bên của khối thạch.Sau đó đậy lamelle lên trên khối thạch. Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm trong đĩa. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử xảy ra (thường là 4 – 5 ngày).
Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên một lame sạch có sẵn một giọt Methylene blue. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần và mô tả đặc điểm: Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn; Hình dạng cuống bào tử; Đặc điểm hình dạng. màu sắc, kích thước bào tử…
2.3.6. Định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của các chủng nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng cacao.
Tiến hành theo phương pháp của Tô Duy Khương (2007)
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự phân giải cơ chất chitin và CMC bởi enzyme chitinase và cellulase. Cơ chất bị phân giải tạo ra các đường khử. Các đường này không cho phản ứng màu với lugol. Vì vậy có thể khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase và cellulase của các chủng nấm khi nuôi cấy chúng trên môi trường có nguồn cơ chất cacbon duy nhất lần lượt là huyền phù chitin và CMC. Khả năng sinh enzyme chitinase và cellulase của các chủng nấm được đánh giá tỷ lệ thuận với đường kính vòng phân giải chitin và cellulose sau khi nhuộm màu với thuốc thử lugol
Tiến hành: Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm: Cấy điểm các chủng nấm thí nghiệm lên môi trường PDA và ủ tại nhiệt độ phòng trong thời gian 7 ngày.
- 44 -
Dùng khoan thạch hình trụ đục một miếng thạch (từ đĩa môi trường PDA đã nuôi cấy nấm thí nghiệm) đặt lên tâm đĩa môi trường cảm ứng MSM có chứa 1% cơ chất (CMC, huyền phù chitin) và ủ trong thời gian 2 ngày.
Sau 2 ngày, nhuộm màu môi trường bằng cách đổ dung dịch lugol vào đĩa thí nghiệm để yên 5 phút rồi rữa sạch bằng nước cất và tiến hành đo đường kính vòng phân giải.
Các thí nghiệm được lặp lại 4 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri.
2.3.7. Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng nấm Trichoderma spp.
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Phạm Thanh Hà và cộng sự (2003)
Nguyên tắc: Môi trường PDA dùng nuôi cấy các chủng Trichoderma phân lập được bổ sung muối NaCl theo dãy nồng độ tăng dần 0.5%, 1%, 2%, 4%, 8%. Khả năng chịu mặn của các chủng Trichoderma phân lập được đánh giá thông qua tỉ lệ thuận với dường kính tản nấm được đo sau 3 ngày nuôi cấy.
Tiến hành: Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm: Cấy điểm các chủng nấm thí nghiệm lên môi trường PDA và ủ tại nhiệt độ phòng trong thời gian 7 ngày.
Dùng khoan thạch hình trụ đục một miếng thạch (từ đĩa môi trường PDA đã nuôi cấy nấm thí nghiệm) đặt lên tâm đĩa môi trường PDA có bổ sung NaCl theo nồng độ đã xác định trước và ủ trong khoảng thời gian 2 ngày và 3 ngày.
Tiến hành đo và ghi nhận đường kính tản nấm phát triển trên đĩa petri sau 2 ngày và 3 ngày nuôi cấy.
Mỗi chủng nấm được lặp lại 4 lần ở mỗi nồng độ muối, mỗi lần lặp lại trên 1 đĩa.
2.3.9. Khảo sát tính đối kháng của chủng nấm Trichoderma spp. với chủng nấm bệnh Phytophthora palmivora trong điều kiện in vitro.
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Dennis và Webster (1971) Nguyên tắc: Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Trichoderma với nấm gây bệnh thối trái khi nuôi cấy đồng thời trên môi trường thạch đĩa PDA.
Tiến hành:
Chuẩn bị nguồn nấm
- 45 -
Đĩa nấm Trichoderma gốc: Cấy điểm các chủng Trichoderma cần khảo sát vào giữa đĩa thạch PDA ủ ở nhiệt độ phòng (7 ngày) làm nguồn đối kháng nấm bệnh.
Đĩa nấm bệnh gốc: Cấy điểm các chủng nấm bệnh cần khảo sát vào giữa đĩa thạch PDA ủ ở nhiệt độ phòng (7 ngày) làm nguồn thử khả năng bị ức chế bởi nấm Trichoderma.
Thí nghiệm đối kháng trực tiếp
Đĩa đối kháng: Dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch có chứa nấm bệnh từ đĩa nuôi cấy nấm bệnh gốc, đặt khoanh thạch cách mép đĩa môi trường PDA là 1cm. Sau 2 ngày cấy nấm bệnh, tiến hành tương tự khoan lấy 1 khoanh thạch có chứa nấm Trichoderma trên đĩa Trichoderma gốc, đặt vào đĩa có chứa nấm bệnh, cách mép đĩa petri 1cm nhưng ở phía đối xứng với nấm bệnh qua tâm đĩa thạch.
Đĩa đối chứng: khoanh thạch nấm bệnh, đường kính 5mm đặt tương tự trên đĩa môi trường PDA cách mép đĩa petri 1cm và không cấy nấm Trichoderma sp.
Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 3 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phòng. Quan sát ghi nhận kết quả sau 3, 5, 7, 9 và 11 ngày nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi
Hiệu quả % ức chế.
Sự phát triển của nấm Trichoderma đối kháng lại nấm bệnh.
Tính toán số liệu
Phần trăm ức chế nấm bệnh được tính theo công thức:
Chú thích: R1: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối chứng khi không có cấy Trichoderma (mm).
R2: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối kháng khi có cấy Trichoderma (mm).
% Ức chế = (R1 – R2)/ R1 . 100 (%)