VI. CÁC ĐẶC TÍNH SINH LÝ
2.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƯƠNG PHÁP DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN
2.3.1. Tách tế ào trần
Tế bào trần (protoplast) là phần của tế bào nằm trong thành tế bào, có khả năng co nguyên sinh và có thể được tách rời khỏi thành tế bào bằng phương pháp cơ học hoặc emzym. Tế bào trần đƣợc bao bọc bởi màng nguyên sinh, nó có thể tái tạo lại thành tế bào mới và phân chia. Tế bào trần có thể tách từ mô hoặc từ các cơ quan thực vật nhƣ lá, rế, hạt phấn hoặc mô sẹo (callus).
Vào những năm 60 của thế kỷ XX, Cooking đã sử dụng một enzyme để phân giải thành tế bào và kết quả là tạo ra các tế bào trần chóp rễ của cây cà chua. Quy trình này cũng đƣợc áp dụng thành công trên nhiều đối tƣợng thực vật khác, rất dễ sử dụng và đạt hiệu quả cao.
Để tách được tế bào trần người ta có thể sử dụng hai phương pháp tách cơ học và tách bằng enzyme. Tách cơ học là làm cho tế bào trần ở trạng thái co nguyên sinh sau đó tác động cơ học để giải phóng tế bào trần. Tuy nhiên phương pháp này có nhiều mặt hạn chế: chỉ áp dụng trên một vài đối tƣợng thực vật; mật độ tế bào trần thu được không cao; khả năng tái sinh yếu. Phương pháp tách tế
bào trần bằng enzyme đã khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm trên. Hiện nay, phương pháp enzyme được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao.
2.3.2. Nu i cấy tế ào trần
Các phương pháp nuôi cấy nói chung đã được nhiều tác giả công bố trong đó có phương pháp nuôi cấy dịch huyền phù và giọt. Tế bào trần được hòa lơ lửng trong môi trường lỏng ở mật độ khoảng 105 tế bào trần/ml trong hộp chứa một lớp mỏng môi trường và nuôi cấy trong điều kiện tĩnh. Quá trình nuôi cấy giọt đã được phát triển bởi Kao et al. (1974). Theo phương pháp này các tác giả đã đặt một giọt (khoảng 50àl) dịch huyền phự tế bào trần (với mật độ 104- 105 tế bào trần /ml trong đĩa petri nhựa, quấn paraphin và nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu.
Một phương pháp khác cũng được sử dụng là nuôi cấy trong thạch. Một thể tích dịch huyền phù có tế bào trần được trộn với một thể tích tương đương của thạch (1-2%) và giữa ở trong 450C trong bể ấm trong một thời gian nhất định, sau đó lấy 5ml hỗn hợp này đổ vào hộp lồng, quấn paraphin xung quanh và tiến hành nuôi cấy (Nagata et al., 1971)
Bên cạnh các phương pháp đã nêu trên người ta còn sử dụng một số các phương pháp nuôi cấy tế bào trần khác như nuôi cấy trong buồng vi nuôi cấy hay nuôi cấy hỗ trợ.
Kao et al. (1975) đã cải tiến môi trường cơ bản để nuôi cấy tế bào trần đơn dòng của loài Vicia hajastana cho nhiều loài khác để tái sinh tế bào trần.
Thông thường môi trường nuôi tế bào trần chứa 3-5% sucrose nhưng với một vài loài (nhu thuốc lá) trong môi trường lượng đường thấp hơn 1%. Vitamin cũng được sử dụng cho môi trường nuôi tế bào trần tương tự như trong môi trường cơ bản. Cả hai chất điều tiết sinh trưởng (auxin và cytokinin) cũng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào trần ở những tỷ lệ khác nhau, ảnh hưởng đến sự tái tạo thành tế bào và sự phân chia của tế bào trần. Nguồn auxin ảnh hưởng đến khả năng hình thành callus từ tế bào trần (2,4D, α-NAA hay IAA). Cytokinin thường được sử dụng là BA, Kinetin, 2-Pi hay zeatin. Tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trường của mỗi loài khác nhau để kích thích sự phân chia hình thành callus của các tế bào trần.
Duy trì áp suất thẩm thấu cho môi trường nuôi cấy là yếu tố cần thiết cho sự ổn định, khả năng sống và sự phát triển tiếp theo của tế bào trần. Trong quá trình tách, nuôi cấy tế bào trần đều phụ thuộc vào sự ổn định của áp suất thẩm
thấu, nó sẽ hạn chế sự vỡ tế bào cho đến khi tái tạo thành tế bào. Áp suất thẩm thấu trong môi trường nuôi cũng quan trọng như trong dung dịch enzym bao gồm sorbitol, manitol, glucose hay sucrose. Với tế bào trần của các cây họ ngũ cốc, đậu thì cả sorbitol và manitol đƣợc chứng minh là thích hợp tạo áp suất thẩm thấu ổn định, còn với tế bào trần của các cây khoai tây, đậu hoa, dứa và sắn thì sucrose là tốt hơn glucose hay manitol, còn với tế bào trần của thuốc lá thì cả galactose và fructose đều đƣợc sử dụng để tạo áp suất thẩm thấu. Áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi dần được giảm bởi việc thêm định kỳ vài giọt môi trường mới để các tế bào trần tái tạo thành và phân chia tạo callus.
2.3.3. Tái sinh tế ào trần
Các tế bào trần sau khi nuôi cấy thường có biểu hiện tăng thể tích tế bào chất, tăng kích thước và phát sinh hầu hết các cơ quan tử (chủ yếu là lục lạp) tụ thành đám quanh nhân (có thể quan sát rõ trên kính hiển vi). Tỷ lệ tái tạo và độ thành thục của thành tế bào trong quá trình nuôi cấy phụ thuộc vào các yếu tố:
giai đoạn phân hóa của tế bào trần, điều kiện tách tế bào trần và tính đặc thù của loài thực vật. Quá trình tái tạo thành tế bào diễn ra ngay vài giờ sau khi tách và có thể hoàn thiện sau 2-7 ngày. Sau khi thành tế bào đƣợc tái tạo hoàn chỉnh, tế bào trần không còn giữ nguyên hình dạng nhƣ ban đầu.
Sự phân chia diễn ra liên tục và tạo thành các cụm đa bào gọi là microcallus (những cụm đa bào này là kết quả của sự tái tạo thành và sự phân chia tế bào). Sự phân chia tiếp tục xảy ra sau 1-3 tuần nuôi cấy và bắt đầu hình thành microcallus. Sau đó các microcallus được chuyển sang môi trường không có áp suất thẩm thấu cao (môi trường cứng) đê tạo thành macrocallus. Các macrocallus khi được chuyển sang môi trường định hướng phân hóa có thể tiếp tục phát sinh thành cơ quan phân hóa nhƣ chồi, rễ, lá.. hay tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình phân chia của tế bào trần để hình thành callus phụ thuộc vào loại, nồng độ và tỷ lệ auxin/cytokinin bổ sung vào môit rường nuôi cấy (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009).
Các tế bào trần đƣợc nuôi cấy trong đĩa petri nhỏ ( 3,5cm hoặc 5cm) với môi trường lỏng phù hợp trong điều kiện tối 250C. Sau 3-4 tuần có thể thấy các microcallus xuất hiện. Các microcallus này sẽ đƣợc cấy chuyển sang đĩa petri lớn ( 9cm) chứa môi trường cứng Cul-medium (Haberlach et al., 1985). Các đĩa petri này đƣợc đặt trong phòng nuôi với quang chu kỳ là 16h chiếu sáng/ngày, nhiệt độ là 220C.
Sau 3-8 tuần có thể thu được các marcocallus với kích thước 0,5-1,5mm nằm trên bề mặt thạch. Các marcocallus được cấy chuyển tiếp sang môi trường tỏi sinh RJM (Mửllers and Wenzel, 1992), đặt trong điều kiện nuụi cấy macrocallus. Khoảng 8-12 tuần sau khi cấy chuyển, marcocallus sẽ tái sinh thể chồi. Các thể chồi được chuyển sang môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) để tạo cây hoàn chỉnh.
2.3.4. Dung hợp tế ào trần
Dung hợp tế bào trần hay tạo thể lai soma là một trong những ứng dụng quan trọng nhất của nuôi cấy tế bào trần Quá trình dung hợp protoplast đƣợc kích thích để hòa trộn 2 bộ genome của 2 loài vào mới nhau trong đó có thể là lai cùng loài, lai khác loài, khác genome hay thậm chí khác giới (điều mà không thể thực hiện được bằng phương pháp lai thông thường). Thực tế là các tế bào trần sau khi đƣợc tách ra, thành tế bào bị phân giải, chúng rất dễ dàng hòa trộn vào với nhau trong điều kiện in vitro (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). Quá trình dung hợp tế bào trần có thể xảy ra một cách tự phát hay do kích thích bằng một số nhân tố nhƣ cơ học, hóa học hay vật lý (gọi chung là dung hợp do kích thích).
2.3.4.1. Dung hợp tự phát
Sau khi các tế bào trần đƣợc tách ra (từ mô callus nuôi cấy hay các tế bào sinh dưỡng) dưới dạng huyền phù nhờ các enzym phân giải thành tế bào, các sợi liên bào (yếu tố kết nối giữa các tế bào tiếp giáp nhau) sẽ bị đứt gãy, từ đó kích thích cá tế bào tiến sát lại gần nhau và xảy ra quá trình dung hợp tự phát hình thành lên các tế bào đa nhân (2-40 nhân).
Kiểu dung hợp này thường hay gặp ở các tế bào callus, với những tế bào có kích thước trung bình, hiếm gặp ở những tế bào sinh dưỡng (mô lá). Chính vì vậy quá trình dung hợp tự phát sẽ không thể tái sinh đƣợc cây hoàn chỉnh mà khả năng phân chia rất ít. Hơn nữa trong quá trình tách tế bào trần hay cấy huyền phù tế bào thường làm cho các tế bào co nguyên sinh mạnh, hoặc làm đứt gãy cả nhóm sợi liên bào nên sẽ làm giảm hiệu suất dung hợp. Do đó kiểu dung hợp này ít đƣợc sử dụng.
2.3.4.2. Dung hợp do kích thích
Sử dụng các nhân tố cơ học, hóa học hay điện năng để kích thích sự dung hợp tế bào trần. Phương pháp dung hợp bằng cơ học: Dùng micropipet trộn đều hỗn hợp hai loại tế bào trần của cùng một loài hay khác loài. Đầu tip của pipet đƣợc giới hạn một cách không hoàn toàn, các tế bào trần đƣợc hút lên hút xuống nhiều lần để tạo thành áp lực dòng chảy nén chúng lại để kích thích sự dung hợp.
Quá trình này dễ làm tổn thương tế bào.
Hai đối tƣợng tế bào đem lai có thể dung hợp thành một tế bào mới một cách tự phát hoặc đƣợc cảm ứng bởi tác nhân nhƣ hóa chất (dung hợp hóa chất polyethylen glycol, ký hiệu là PEG) hay xung điện (dung hợp xung điện- electrofusion). Đối với cây khoai tây người ta đã sử dụng cả hai phương pháp trên. Tuy nhiên so với phương pháp dung hợp bằng hóa chất, dung hợp xung điện đƣợc áp dụng phổ biến và đạt hiệu quả cao hơn hơn do thao tác đơn giản, tốc độ nhanh, hiệu suất dung hợp cao trong cùng một thời điểm và ít gây độc đối với tế bào. Phương pháp dung hợp bằng hóa chất PEG thường gây độc cho tế bào trần do không rửa sạch hết PEG, do vậy sẽ ảnh hưởng đến khả năng tái sinh sau này (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009).
2.3.5. Chọn lọc các con lai soma
Nhìn chung khoảng 20%-25% tế bào trần có thể bị kích thích dung hợp bởi các yếu tố kích thích mặc dù sự hình thành thể nhân có thể là 50-70%
(Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). Tuy nhiên, sự nhận biết các thể dị nhân là không đơn giản, cần phải có các phương pháp chọn lọc đặc trung. Việc tách được các cá thể lai heterocariot (dị nhân) ra khỏi các cá thể đồng dung hợp hay chƣa dung hợp khi tái sinh là hết sức quan trọng. Trong mục tiêu nghiên cứu lý thuyết, người ta có thể sử dụng các bố , mẹ có đặc trưng rất khác nhau để dễ dàng thanh lọc ra các thể lai trên môi trường chọn lọc.
Bằng các phương pháp chỉ thị phân tử (AFLP, RAPD, RELP, PCR) hoặc Isozyme có thể xác định chính xác các con lai soma mang các gen của cả bố và mẹ dung hợp.
Theo Thach et al. (1993) đã tạo thành công con lai soma giữa các nhóm khoai tây thuộc Solanum tuberosum L., việc xác định con lai dựa trên phân tích isozyme esterase, peroxidase và kỹ thuật RFLP (Enzyme cắt là EcoRI) đã xác định đƣợc các con lai đều có sự biểu hiện của 2 allele trội đơn gen Rx và Ry từ bố mẹ dung hợp (partners).
Theo Thieme et al. (2008), con lai giữa Solanum tuberosum cv. Delikat và S. tarnii đƣợc xác nhận bằng chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeat) và AFLP (Amplified Fragment length polymorphism), đồng thời cũng dựa vào đặc điểm hình thái và phân tích Flow cytometry. Kết quả cho thấy chỉ thị SSR không cho kết quả với tổ hợp lai trên và các con lai BC1 còn AFLP cho kết quả
tốt để khẳng định đúng con lai soma.
Ngoài ra, để xác định con lai soma một số tác giả đã nghiên cứu thành phần, hàm lƣợng alkaloid trong các cây lai. Theo Laurila et al. (1996) để xác định con lai soma tiến hành phân tích thành phần SGAA (Steroidal Glycoalkaloid Aglycone) của cây lai. Kết quả cho thấy các thành phần alkaloid của bố mẹ bao gồm solanidine và slanthrene của S. tuberosum, tomatidine của S.
brevidens đều có mặt trong cây lai. So sánh với bố mẹ, cho biết thành phần SGAA trong cây lai cao hơn so với S. tuberosum nhƣng hàm lƣợng thấp vào khoảng 20 mg/ 100g trọng lượng tươi.
Hơn nữa người ta có thể xác định con lai dựa vào đặc điểm hình thái khi bố mẹ có đặc điểm khác nhau rõ rệt. Tuy nhiên phương pháp này chỉ được áp dụng đồng thời với phương pháp xác định ở mức phân tử thì mới cho kết quả chính xác nhất.