4.1.2.1. Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lượng tế bào sau dung hợp
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lượng tế bào sau dung hợp
Tế bào trần của dòng dại Solanum bulbocastanum với giống Delikat ở mật độ 2 x 105 tế bào/ml đƣợc dung hợp với các thông số xung điện khác nhau. Chất lƣợng tế bào thu đƣợc sau xung điện đƣợc thể hiện qua bảng 4.3.
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lượng tế ào sau dung hợp (Nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum bulbocastanum và Delikat)
STT CT Thời gian tế bào phân chia (ngày)
Thời gian xuất hiện microcallus* (ngày)
Số lƣợng macrocallus** đĩa
1 CT1 3 21 49,5
2 CT2 2 18 65,4
3 CT3 4 28 27,6
4 CT4 4 24 38,2
Chú thích: CT1- AC=700 kHz+ 3 lần xung (Rokka et al, 1994), CT2- 800 kHz+ 2 lần xung, CT3- 900 kHz+2 lần xung, CT4- 1000KHz+1 lần xung; (*) microcallus- tiểu callus; (**) macrocallus- đại callus
Chất lƣợng tế bào của tổ hợp Solanum bulbocastanum và Delikat sau dung hợp đƣợc thể hiện qua hình 4.2.
Hình 4.2. Chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở các tần số và số lần xung khác nhau (nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum bulbocastanum và Delikat)
Chú thích: A-chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở tần số 700 kHz+ 3 lần xung, B- chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở tần số 800 kHz+ 2 lần xung, C- chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở tần số 900 kHz+ 2 lần xung,
D- chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở tần số 1000 kHz+ 1 lần xung
A C
B D
Tần số và số lần xung hợp ảnh hưởng rõ rệt đến chất lượng tế bào sau dung hợp (bảng 4.3, hình 4.2).
Ở tần số 700 kHz và 3 lần xung, tế bào thu đƣợc sau dung hợp hầu nhƣ bị vỡ nát, những tế bào sống sót sau 5 ngày nuôi cấy mới có hiện tƣợng phân chia và sau 27 ngày microcallus mới hình thành, tỷ lệ hình thành macrocallus từ microcallus thấp trung bình chỉ có 9,5 macrocallus/đĩa.
Tế bào đƣợc dung hợp ở các thông số của CT2 (tần số 800kHz và 2 lần xung), tế bào có tỷ lệ nguyên vẹn cao, thời gian xuất hiện hiện phân chia sớm (sau 2 ngày nuôi cấy), các microcallus hình thành sau 18 ngày nuôi cấy trên môi trường lỏng, số macrocallus hình thành/đĩa nhiều nhất (trung bình 65,4 macrocallus/đĩa).
Khi tăng tần số xung lên 900 kHz và giữ nguyên số lần xung (CT3) thì tỷ lệ tế bào vỡ tăng, tế bào phân chia muộn hơn so với CT2 (4 ngày), số macrocallus hình thành chỉ đạt 27,6 macrocallus/đĩa. Tương tự, khi dung hợp ở tần số 1000 kHz và 1 lần xung sau 3 ngày tế bào mới phân chia và số macrocallus/đĩa đạt 38,2 macrocallus.
Nhƣ vậy dung hợp ở thông số 800 kHz và 2 lần xung là thích hợp nhất cho dung hợp xung điện giữa các dòng khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội.
4.1.2.2. Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến sự hiệu suất dung hợp Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến sự hiệu suất dung hợp
Tiến hành thí nghiệm dung hợp xung điện tế bào giữa dòng khoai tây dại Solanum bulbocastanum và giống Delikat ở mật độ khác nhau để xác định mật độ thích hợp nhất cho tỷ lệ con lai lục bội cao nhất (6x=72), kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.4.
Mật độ ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian bắt đầu phân chia tế bào và tỷ lệ con lai lục bội tạo thành. Mật độ tế bào tham gia dung hợp càng cao thì tế bào phân chia sớm và tỷ lệ con lai con lai lục bội (6x) càng tăng (bảng 4.4).
Ở mật độ dung hợp 1 x 105 tế bào/ml sau 3 ngày tế bào mới phân chia, tỷ lệ con lai tái sinh có độ bội 2x cao nhất (56,3%) trong khi đó con lai có độ bội 6x chỉ đạt 18,7%.
Khi tăng mật độ dung hợp từ 2 x 105 tế bào/ml đến 5 x 105 tế bào/ml, tế bào cảm ứng nhanh và phân chia chỉ sau 2 ngày nuôi cấy. Tỷ lệ con lai 6x lại tăng ở hai mật độ dung hợp này (53,2% và 65,6% con lai là con lai 6x khi dung hợp ở mật độ 4 x 105 tế bào/ml và 5 x 105 tế bào/ml)
Bảng 4.4. Kết quả tái sinh và độ ội của các con lai tái sinh sau dung hợp ở các mật độ tế ào dung hợp khác nhau (Nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa
Solanum bulbocastanum và Delikat) Mật độ
xung hợp tế ào
ml)
Thời gian xuất hiện phân chia (ngày)
Số
macrocallus* đĩa Sau 4 tuần
Số cây tái sinh
(cây) Sau 8 tuần
Tỷ lệ cây 2x (%)
Tỷ lệ cây 4x (%)
Tỷ lệ cây 6x
(%)
1x 105 3 28,5 16 56,3 25,0 18,7
2 x 105 2 75,7 35 37,1 34,3 28,6
3 x 105 2 85,6 46 13,9 45,6 40,5
4x 105 2 68,3 47 14,9 31,9 53,2
5 x 105 2 62,6 29 10,3 24,1 65,6
Chú thích: dung hợp với các thông số AC= 800 kHz, DC=120V và 2 lần xung; (*) macrocallus- đại callus
Nhƣ vậy mật độ xung cho hiệu quả dung hợp tạo con lai 6x cao nhất là từ 4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml.
4.1.2.3. Ảnh hưởng của kiểu gen khác nhau đến khả năng tái sinh tế bào sau dung hợp
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của kiểu gen khác nhau đến khả năng tái sinh tế bào sau dung hợp
Tế bào trần của các dòng khoai tây dại và các giống khoai tây trồng đƣợc tách, pha loãng tạo mật độ 4 x 105 tế bào trần/ml trong dung dịch dung hợp và trộn theo tỷ lệ 1:1. Sử dụng máy xung điện máy xung điện CFA 500 (Krüss GmbH, Hamburg) với các thông số nhƣ kết luận ở thí nghiệm 3. Sau dung hợp tế bào được nuôi cấy trên môi trường VKM II (Thieme et al., 1997). Các microcalli đƣợc hình thành sau 2-3 tuần nuôi cấy. Cấy chuyển các microcalli màu xanh, tươi với đường kính khoảng 2-3 mm sang môi trường tái sinh macrocallus (Cul- medium). Các macrocallus này sẽ hình thành các chồi đầu tiên sau 8-12 tuần nuôi cấy tùy thuộc vào tổ hợp dòng khoai tây nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày ở bảng 4.5.
Toàn bộ các tổ hợp dung hợp phân chia tế bào xảy ra sau 2-3 ngày nuôi cấy.
Khả năng tạo macrocallus và tái sinh chồi phụ thuộc vào tổ hợp dung hợp hay phụ thuộc vào bản chất di truyền của dòng cây nghiên cứu. Tổng cộng đã tạo đƣợc 07 tổ hợp lai giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng (bảng 4.5, hình 4.3).
Hình 4.3 cho thấy sự phân chia hình thành callus của các tổ hợp lai khác nhau sau dung hợp phụ thuộc vào bản chất di truyền. Các tổ hợp lai giữa giống khoai tây trồng Atlantic với các dòng khoai tây dại khác nhau cho kết quả khác nhau.
Bảng 4.5. Kết quả dung hợp giữa các dòng khoai tây dại nhị ội với các giống khoai tây trồng tứ ội ằng phương pháp xung điện
STT Tên tổ hợp lai Số lƣợng callus tái sinh
Số lƣợng chồi tái sinh
Tỷ lệ tái sinh (%)
1 trn3G + Agave 120 39 32,5
2 trn3G + Rasant 97 25 25,8
3 blb2G + Delikat 250 31 12,4
4 trn3G + Delikat 250 64 25,6
5 Pnt2G + Atlantic 193 23 11,9
6 blb2G + Atlantic 307 4 1,3
7 trn3G + Atlantic 395 2 0,5
Hình 4.3. Các macrocallus tái sinh sau khi dung hợp nu i cấy trên m i Cul-medium sau 3 tuần nu i cấy
Chú thích: 1. Tổ hợp blb2G + Atlantic; 2- Tổ hợp pnt2G +Atlantic; 3- Tổ hợp trn3G+Atlantic