4.1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến kết quả tái sinh sau khi dung hợp
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến kết quả tái sinh sau khi dung hợp
Tế bào trần của các dòng khoai tây dại nhị bội và các giống khoai tây trồng tứ bội đƣợc dung hợp bằng xung điện theo quy trình đã đƣợc tối ƣu hóa ở giai đoạn trước. Tế bào trần sau khi dung hợp được nuôi cấy trên môi trường VKM II (Thieme et al., 1997) ở các nền khác nhau (lỏng; bán lỏng và rắn). Kết quả đƣợc thể hiện trên bảng 4.6 và hình 4.4.
Ảnh hưởng của điều kiện môi trường khác nhau đến sự phân chia của tế bào trần là rất rõ rệt (bảng 4.6). Trên môi trường lỏng, tế bào trần của các các tổ hợp lai bắt đầu phân chia sau 2-3 ngày nuôi cấy và tạo microcallus sau khoảng 2
1 2 3
tuần nuôi cấy. Trong khi đó các tế bào trần trên môi trường bán lỏng (nhỏ giọt agar) có thời gian xuất hiện phân chia lâu hơn (sau từ 4-7 ngày). Trên môi trường rắn, các tế bào hầu nhƣ không có khả năng phân chia hoặc chỉ có rất ít tổ hợp có xuất hiện phân chia tế bào (blb + Delikat; trn + Delikat; blb + Atlantic) nhƣng sau thời gian lâu hơn rất nhiều (trên 9 ngày). Điều này rất đúng với lý thuyết là môi trường nuôi cấy tế bào trần phải đảm bảo được sự cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trường và nội bào, nồng độ Ca2+ trong môi trường nuôi cấy tế bào trần thường cao hơn 2-4 lần so với môi trường bình thường cho tới khi tái sinh được vách tế bào được hình thành và hình thành microcallus. Như vậy chỉ có môi trường lỏng mới đảm bảo đƣợc các điều kiện trên.
Bảng 4.6. Sự phân chia của các tổ hợp lai sau khi dung hợp trên các điều kiện m i trường khác nhau*
Tổ hợp lai
Thời gian xuất hiện tế ào phân chia (ngày)
Thời gian xuất hiện microcallus (ngày) Lỏng Bán lỏng Rắn Lỏng Bán lỏng Rắn
trn3G + Agave 3 4 - 12 21 -
trn3G + Rasant 3 3 - 14 21 -
blb2G + Delikat 2 5 15 11 26 -
trn3G + Delikat 3 6 9 12 25 -
pnt2G + Atlantic 2 6 - 10 22 -
blb2G + Atlantic 3 5 11 12 23 -
trn3G + Atlantic 3 4 - 14 24 -
Chú thích: (*)10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp đƣợc theo dõi sự phân chia tế bào nuôi cấy trên môi trường VKM II trong điều kiện tối, nhiệt độ 20-220C; (-) tế bào không phân chia.
Hình 4.4. Sự phân chia của tổ hợp lai trn3G + Delikat trên các điều kiện môi trường khác nhau sau 4 ngày nuôi cấy
Chú thích: 1- VKM II lỏng; 2- VKM II bán lỏng; 3- VKM II rắn
1 2 3
Điều kiện môi trường cũng có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng phân chia tạo microcallus của các tế bào trần sau dung hợp. Trên môi trường lỏng, hầu nhƣ các tế bào phân chia tạo hạt microcallus sau khoảng 10-14 ngày với chất lƣợng microcallus trắng sáng, kích thước hạt to như hạt tấm. Khả năng hình thành microcallus trên môi trường bán lỏng chậm hơn (sau khoảng 20 ngày) và chất lượng microcallus kém hơn (xuất hiện nhiều microcllus màu nâu sáng, hạt nhỏ). Trên môi trường rắn các tế bào không có khả năng phân chia hình thành microcallus.
4.1.3.2. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia của các tổ hợp lai sau dung hợp
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia của các tổ hợp lai sau dung hợp
Tế bào trần của các tổ hợp lai sau khi dung hợp đƣợc nuôi cấy trên các loại môi trường lỏng khác nhau: môi trường VKM II (Thieme et al., 1997), Medium A* (Ehsanpour et al., 2001), KM8P* (Paula Conde et al., 2006) đƣợc trình bày ở bảng 4.7.
Bảng 4.7. Sự phân chia của các tổ hợp lai trên các m i trường nu i cấy khác nhau
Tổ hợp lai
Thời gian xuất hiện tế ào phân chia
(ngày)
Thời gian xuất hiện microcallus
(ngày)
Số lƣợng microcallus trung
ình đĩa petri VKMII A* KM8P* VKMII A* KM8P* VKMII A* KM8P*
trn3G + Agave 3 5 6 12 - - 22,7 - -
trn3G + Rasant 3 4 5 14 21 - 13,3 4,4 -
blb2G + Delikat 2 7 5 11 - - 29,6 - -
trn3G + Delikat 3 9 4 12 21 - 35,7 - 5,8
Pnt2G + Atlantic 2 6 6 10 - 22 48,3 - 1,3
blb2G + Atlantic 3 9 4 12 - - 5,1 - -
trn3G + Atlantic 3 7 8 14 21 - 9,4 5,9 -
Chú thích: 10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp đƣợc theo dõi sự phân chia tế bào nuôi cấy trên môi trường lỏng trong điều kiện tối, nhiệt độ 20-220C; (-) tế bào không phân chia.
Trên môi trường A* và KM8P*, thời gian bắt đầu phân chia của tế bào trần của các dòng khoai tây nghiên cứu là 4-9 ngày. Tốc độ phân chia tế bào thấp và không đồng đều. Hầu nhƣ các tế bào trần không hình thành đƣợc microcallus và chết sau 2 tuần nuôi cấy. Chỉ có rất ít tổ hợp lai có hình thành microcallus trên môi trường A* và KM8P* nhưng sau thời gian rất lâu (bảng 4.7).
Các tế bào trần nuôi cấy trên môi trường VKMII bắt đầu phân chia chỉ sau 2-3 ngày nuôi cấy tùy thuộc vào dòng khoai tây nuôi cấy. Sau 3 ngày nuôi cấy, toàn bộ các dòng đều phân chia và tạo microcallus sau 2 tuần nuôi cấy. Các tổ hợp lai khác nhau cũng có sự phân chia và sự hình thành microcallus khác nhau trên môi trường VKMII. Như vậy: môi trường VKMII là môi trường thích hợp để nuôi cấy tạo microcallus của tế bào trần sau khi dung hợp.
4.1.3.3. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh chồi của các tổ hợp lai
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh chồi của các tổ hợp lai
Các tổ hợp lai sau khi dung hợp phân chia tạo microcallus trên môi trường lỏng VKMII được cấy chuyển sang môi trường Cul-medium (theo Thieme et al., 2008) để tạo các macrocallus. Các macrocallus được cấy chuyển sang môi trường tái sinh tạo chồi. Thí nghiệm theo dõi 10 đĩa petri/tổ hợp lai, mỗi đĩa petri cấy 10 macrocallus (đường kính từ 2-4mm). Mỗi callus chỉ lấy 1 chồi đầu tiên và lấy số lƣợng chồi trung bình/đĩa. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 4.8, hình 4.5.
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của m i trường tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai
Tổ hợp lai Số lƣợng chồi tái sinh chất lƣợng chồi
M i trường RJM M i trường MSO M i trường K8P
trn3G + Agave 3,3/++ 0,8/+ 2,5/+
trn3G + Rasant 5,5/++ 1,6/+ 1,3/+
blb2G + Delikat 6,5/++ 0/- 2,4/+
trn3G + Delikat 8,8/++ 0/- 0,8/-
pnt2G + Atlantic 6,4/++ 1,65/+ 0/-
blb2G + Atlantic 1,7/+ 0/- 0/-
trn3G + Atlantic 2,3/- 0/- 0/-
(-): Chồi yếu, màu trắng; +: Chồi phát triển trung bình, màu vàng nhạt; ++: chồi tốt, mập, xanh
Môi trường khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tái sinh tạo chồi của các tổ hợp lai. Nhìn chung, trên môi trường MSO và K8P, các callus của các tổ hợp lai tái sinh kém, số chồi trung bình /đĩa chỉ đạt từ 0-2,5 chồi/đĩa. Nhiều đĩa không có khả năng tái sinh chồi. Trên môi trường RJM, hầu như các tổ hợp lai đều có khả năng tái sinh tạo chồi với số chồi trung bình/đĩa dao động từ 1,3-9,1 chồi/đĩa. Khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai khác nhau cũng khác nhau rõ rệt.
Các tổ hợp lai trn3G + Delikat, pnt3G +Atlantic có khả năng tái sinh cao với số
chồi trung bình/đĩa lần lƣợt là 8,8 và 6,4. Các chồi này phát triển tốt, màu xanh.
Tổ hợp lai blb2G +Atlantic; trn3G +Atlantic có khả năng tái sinh kém, chất lƣợng chồi kém, màu trắng xốp (bảng 4.8).
Hình 4.5 Khả năng tái sinh chồi của tổ hợp lai trn + Rasant sau 12 tuần trên m i trường khác nhau
1- Môi trường RJM; 2- Môi trường MSO; 3- Môi trường K8P.
Tổng hợp các kết quả nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp thì thấy đã tái sinh đƣợc tổng số 1612 callus và tạo đƣợc 188 chồi trong đó tỷ lệ tái sinh chồi của các tổ hợp lai khác nhau rõ rệt (bảng 4.9).
Bảng 4.9. Kết quả nu i cấy tái sinh chồi của các tổ hợp lai sau dung hợp
Tên tổ hợp lai Số lƣợng callus tái sinh
Số lƣợng chồi tái sinh
Tỷ lệ tái sinh (%)
trn3G + Agave 120 39 32,5
trn3G + Rasant 97 25 25,8
blb2G + Delikat 250 31 12,4
trn3G + Delikat 250 64 25,6
pnt2G +Atlantic 193 23 11,9
blb2G + Atlantic 307 4 1,3
trn3G + Atlantic 395 2 0,5
Tổng số 1612 188