Đánh giá tính kháng ệnh mốc sương của các con lai soma ằng lây nhiễm nhân tạo và ằng chỉ thị phân tử

Một phần của tài liệu Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sương bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng (Trang 55 - 59)

PHẦN 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.3. Đánh giá tính kháng ệnh mốc sương của các con lai soma ằng lây nhiễm nhân tạo và ằng chỉ thị phân tử

Sau khi nuôi cấy các cây lai soma khoảng 4 tuần trong điều kiện in vitro, các dòng bố mẹ và các con lai soma đƣợc chuyển vào chậu vại trong điều kiện nhà kính. Quan sát các đặc tính sinh trưởng, hình thái, sinh sản và khả năng kháng bệnh. So sánh giữa các dạng dại, khoai tây trồng và con lai soma.

3.4.3.1. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử

a. Thí nghiệm 11: Phân lập nấm Phytophthora infestans và đánh giá độc tính của nguồn nấm thu thập được

Nguồn nấm bệnh được thu từ các cây khoai tây bị bệnh mốc sương tại 2 vùng trồng khoai tây thƣợc hà Nội và lạng Sơn. Các lá bệnh sau khi thu thập đƣợc nuôi trên lát cắt củ khoai tây trong điều kiện tối, nhiệt độ 18 – 20oC, độ ẩm cao ở mức 90 – 100%. Sau khi lây nhiễm từ 6-7 ngày, thu các sợi bào tử nấm trong dung dịch nước cất. Đếm mật độ bọc động bào tử bằng phương pháp đếm tế bào hồng cầu để có đƣợc dung dịch lây nhiễm nhân tạo (1,5x104 bọc động bào tử/ml). Nguồn nấm này được liên tục nuôi trên lát cắt củ để lưu giữ (Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009).

Thí nghiệm đƣợc lặp lại 5 lần, dùng hàm variance để xử lý số liệu thống kê cho biết đƣợc mức độ sai khác có ý nghĩa hay không ý nghĩa đối với các nguồn nấm bệnh thu thập đƣợc.

Thời gian và địa điểm thực hiện: Thí nghiệm đƣợc thực hiện năm 2013 tại Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (nay là Học viện Nông nghiệp Việt Nam)

b. Thí nghiệm 12: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời – Detached Leaflet Assay

Mẫu lá khoai tây đƣợc lấy từ các cây trồng trong chậu vại hoặc trên đồng ruộng ở giai đoạn cây chuẩn bị ra hoa. Dùng kéo sắc để cắt các lá đơn, trong quá trình cắt tránh làm tổn thương bề mặt lá. Mỗi kiểu gen lặp lại 5 lần (lấy 5 lá).

Nhỏ dung dịch lây nhiễm với nồng độ 1,5x104 bọc động bào tử/ml (mỗi giọt khoảng 20 - 30àl) lờn trờn lỏ, đặt trong điều kiện 16 giờ chiếu sỏng, nhiệt độ 18 – 200C, độ ẩm trên 90%. Triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện sau 5-6 ngày sau khi lây nhiễm.

Phương pháp đo vết bệnh trên lá: đo kích thước vết hoại tử bề mặt trước của lá và đo mật độ hình thành bào tử nấm ở bề mặt sau của lá. Sử dụng kính hiển vi để quan sát (Theo Darsow et al., 2004, 2008; Hammann et al., 2009).

Cách đo kích thước vết hoại tử bề mặt trước của lá như sau: Điểm 1: không có vết bệnh ở cả mặt trước và mặt sau lá; điểm 2: có 1 điểm ở bề mặt sau lá; không có vết bệnh ở bề mặt trước lá; điểm 3: 1-4 % vùng lá bị nhiễm bệnh, khoảng 4 cm2; điểm 4: 5-12% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 5: 13-30% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 6: 31-55% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 7: 56-78% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 8: 79-96% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 9: 97- 100% diện tích lá bị nhiễm bệnh. Cách đo sự hình thành bào tử nấm ở bề mặt sau của lá: điểm 1: từ không có triệu chúng vết bệnh hoặc vết hoại tử 2-4mm;

điểm 2: nhiễm trung bình 5-55% diện tích bề mặt lá; điểm 3: 56-100% diện tích lá bị nhiễm bệnh.

Thời gian và địa điểm thực hiện: Thí nghiệm đƣợc thực hiện năm 2013 tại Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (nay là Học viện Nông nghiệp Việt Nam).

c. Thí nghiệm 13: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ (Tuber slice test)

Củ mới đƣợc thu hoạch (trong vòng 24h) hoặc cho các củ đƣợc bảo quản trong kho lạnh từ 1 – 2 tháng ở nhiệt độ 8 – 90C. Mỗi kiểu gen đƣợc lặp lại 5 lần (5 lát củ).

Nhỏ lờn mỗi lỏt củ 1 giọt dung dịch dịnh lõy nhiễm (20 - 30àl) với nồng độ 1,5x104 bọc động bào tử/ml, trong điều kiện tối, nhiệt độ 18 – 20oC, độ ẩm cần đảm bảo ở mức 90% đến bão hòa. Ngày hôm sau tiến hành lật đảo bề mặt lát củ.

Triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện sau 7-10 ngày. Đánh giá và cho điểm dựa vào kích thước vết hoại tử (Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009). Cách tính điểm nhƣ sau: điểm 1: không có vết bệnh; điểm 2: 1% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (20mm2); điểm 3: 0,5-5% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (150mm2); điểm 4:

6-12% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (300mm2); điểm 5: 25% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 6: 43% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 7: 62% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 8: 85% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 9: 96- 100% diện tích củ bị nhiễm bệnh.

Thời gian và địa điểm thực hiện: Thí nghiệm đƣợc thực hiện năm 2013 tại Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (nay là Học viện Nông nghiệp Việt Nam).

d. Thí nghiệm 14: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên đồng ruộng (Field test)

Thí nghiệm trên đồng ruộng đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại có 15 cây trên 3 luống (bao gồm cả các giống đối chứng và các dòng mang gen kháng R). Nồng độ dung dịch lâu nhiễm là 20 x 103 bọc động bào tử/ml. Tiến hành lây nhiễm tại thời điểm khi cây bắt đầu hoặc kết thúc có hoa vào lúc tối muộn khi trời ẩm ƣớt (lây nhiễm theo kiểu dạng dạng phun mù). Triệu chứng sẽ bắt đầu xuất hiện sau 1 tuần lây nhiễm.

Tiến hành đo vết bệnh ít nhất 5 lần khi sự nhiễm bệnh bắt đầu từ 0,1% - 100%. Đánh giá phản ứng của bệnh trong toàn bộ quá trình phát triển của bệnh theo chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (Area Under Disease Progress Curve - AUDPC) và chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian tương đối (r) AUDPC; Phân tích sự sai khác (variance) đƣợc sử dụng để đánh giá tất cả các giống. Kết quả có thể đƣợc so sánh với giống đối chứng) (Truberg et al., 2008). Giá trị chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian được tính theo công thức dưới đây:

Sự thành thục của cây có tương quan chặt chẽ với tính kháng bệnh. Đánh giá sự thành thục của cây theo thang điểm từ 1-9 trong đó: 1=chín sớm ; 9=chín muộn.

Thời gian và địa điểm thực hiện: Thí nghiệm đƣợc thực hiện năm 2013 tại Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI - CHLB Đức).

e. Thí nghiệm 15: Đánh giá sự có mặt của gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ thị phân tử

Các con lai soma và các dòng đối chứng đƣợc trồng trong chậu trong điều kiện nhà kính. Lấy lá để tách chiết ADN theo phụ lục 11.

Xác định các gen kháng Rpi-blb ở các con lai soma có sử dụng các mồi đặc hiệu của các gen: Rpi-blb1 (Wang et al., 2008) và Rpi-blb3 (Lokossou et al., 2010) (bảng 3.3).

Thời gian và địa điểm thực hiện: Thí nghiệm đƣợc thực hiện năm 2013 tại Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (nay là Học viện Nông nghiệp Việt Nam).

3.4.3.2. Đánh giá con lai soma về các tính trạng nông sinh học

Thí nghiệm 16: Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học

Các dòng con lai soma và các dòng bố mẹ sau nuôi cấy in vitro 4 tuần đƣợc trồng vào vụ Đông – Xuân năm 2013-2014 tại cánh đồng thực nghiệm- Viện Sinh học Nông nghiệp để đánh giá các tính trạng về hình thái, sinh trưởng, phát triển, các yếu tố cấu thành năng suất cũng nhƣ khả năng kháng bệnh. Thí nghiệm đƣợc bố trí 3 lần lặp cho mỗi dòng, mỗi lần lặp lại 10 cây.

n=1

AUDPC = ∑ (yi + yi+1) ( ti+1 –ti)/2 i=1

Trong đó: n= số lần đo bệnh

yi = cường độ bệnh (chỉ số bệnh hoặc tỷ lệ bệnh) ti = thời gian tồn tại lần đo thứ i

(∆)rAUDPC: Hệ số kháng bệnh điều chỉnh theo độ thành thục của cây (∆)rAUDPC = AUDPC/max AUDPC

n-1

(∆)rAUDPC = AUDPC/max AUDPC = AUDPC/ ∑ 100 (ti+1 –ti) i=1

Trong đó: ti+1 - ti = tổng thời gian dịch bệnh

Phương pháp đánh giá: Theo tiêu chuẩn ngành (số 32-1998/QĐ-BNN- KHCN ngày 24 tháng 2 năm 1998) và quy chuẩn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (QCVN 01- 69:2011/BNNPTNT) (Phụ lục 14).

Thời gian và địa điểm thực hiện: Thí nghiệm đƣợc thực hiện năm 2013- 2014 tại Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (nay là Học viện Nông nghiệp Việt Nam).

Một phần của tài liệu Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sương bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng (Trang 55 - 59)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(147 trang)