VI. CÁC ĐẶC TÍNH SINH LÝ
2.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY
2.5.3. Chọn tạo giống khoai tây ằng phương pháp dung hợp tế ào trần
Có rất nhiều biện pháp đã đƣợc đƣa ra để hạn chế tác hại của bệnh mốc sương gây ra như sử dụng tập đoàn giống mới cho các vùng nhiễm bệnh, sử dụng các thuốc hoá học nhƣng chƣa đem lại kết quả nhƣ mong đợi. Các nghiên cứu gần đây cho thấy các loài khoai tây dại nhƣ S. pinatisectum, S. tarnii, S. bulbocastanum mang nguồn gen kháng bệnh mốc sương cao. Tuy nhiên rất khó để chuyển đặc tính kháng này qua lai tạo hữu tính giữa các loài dại (2n = 2x
= 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do sự không tương hợp về genom, sự bất thụ trong lai xa. Để khắc phục hiện tƣợng này, lai soma (dung hợp tế bào) đƣợc áp dụng để chuyển tính kháng mốc sương từ khoai tây dại vào khoai tây trồng.
Đây là hướng đi đúng đắn và đã được nhiều nghiên cứu chứng minh về khả năng chuyển các đặc tính quý của các loài khoai tây khác nhau thông qua dung hợp tế bào (Mattheij et al., 1992; Thach et al., 1993; Thieme et al., 2000, 2008, 2010).
Hướng nghiên cứu mới là sử dụng nguồn gen khoai tây dại có đặc tính kháng bệnh mốc sương rất điển hình làm nguyên liệu dung hợp trực tiếp với các dòng khoai tây trồng để tạo các con lai soma mang đặc tính chống chịu virus mốc sương và rệp truyền bệnh Các dòng lai này sẽ được sử dụng làm vật liệu lai lại với chính bố mẹ của chúng. Kết quả tạo ra các dòng khoai tây trồng trọt mang đặc tính kháng bệnh virus rõ rệt cùng với các đặc tính nông sinh học tốt của bố mẹ. Đã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng nguồn gen khoai tây dại để chuyển vào các giống khoai tây trồng bằng dung hợp tế bào trần và lai hữu tính (Thieme et al., 2010): S. Chacoense (Butenko et al., 1982); S.niggrum (Binding et al., 1982, 1988); S.brevidens (Austin et al., 1985; Helgeson, 1993); S.circaeifolium (Mattheij et al., 1992); S.berthaultii (Serraf et al.,1991); S.commersonii (Cardi et al., 1993); S.khasianum, S.aculeatissimum (Stattmann et al., 1994); S.torvum (Jadari et al., 1992); S.phureja (Puite et al., 1986); S.pinnatisectum (Sidorov et al., 1987, 1994; Schilde-Rentschler et al., 1993; Thieme et al., 1995);
S.bulbocastanum (Austin et al., 1993; Brown et al., 1995; Schilde-Rentschler et al., 1993; Thieme et al., 1995).
Mê-xi-cô là một trung tâm phát sinh của cả P. infestans và các loài khoai
tây dại. Nơi đây đã tồn tại các chủng P. infestans có hoạt tính mạnh nhất và độc hại nhất. Sở dĩ các loài khoai tây dại có thể sống đƣợc ở đây là do chúng có khả năng kháng cao với hầu hết các chủng gây bệnh. Do đó, các loài khoai tây dại này nhƣ một nguồn cung cấp gen giàu có cho quá trình cải tiến giống khoai tây của các nhà chọn tạo giống và các nhà di truyền học. Chi Petota thuộc họ Solanum gồm khoai tây trồng và các loài dại thân thuộc của chúng, gồm khoảng 200 loài dại. Trong chúng có các loài có khả năng kháng với các loại bệnh và dịch hại cũng nhƣ các stress phi sinh học. Nhiều loài đã đƣợc bảo tồn trong ngân hàng gen khoai tây quốc tế ở Đức (The Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, IPK, Genebank) và các nước khác, chúng đã được đánh giá và khai thác cho chương trình chọn tạo giống khoai tây. Chúng được đánh giá một cách có hệ thống về các tính kháng và sự hình thành năng suất, chúng đƣợc ghi vào danh sách và lưu trữ nhằm để cung cấp các tính trạng vốn không có ở nguồn gen cây trồng. Để khai thác các dòng khoai tây dại, có hàng loạt các công bố theo hướng này.
Thieme et al. (1997) đã lai tạo thành công giữa khoai tây trồng S.
tuberosum (2n = 2x và 2n = 3x) với 2 loài khoai tây dại nhị bội Mê-xi-cô (S.pinnasisexta và S.bulbocastana) qua dung hợp tế bào trần bằng xung điện. Sắc xuất thành công của dung hợp đạt 63-89%. Tỷ lệ thành công cao này có thể đƣợc giải thích là do các protoplast của bố mẹ đã bị chết hoặc các con lai có khả năng tái sinh cao hơn so với các dạng bố mẹ. Qua phân tích isozym và chỉ thị phân tử (RAPD) đã chọn lọc đƣợc các con lai soma tổ hợp đƣợc các đặc tính nông sinh học quý của khoai tây trồng S. tuberosum và khả năng kháng bệnh mốc sương cao của các loài khoai tây dại.
Dinu and Thieme (2000) đã tạo thành công tổ hợp lai giữa các loài khoai tây dại với các giống khoai tây trồng S. tuberosum L., các dòng khoai tây chọn tạo giống và các dòng nhị bội nhằm để chuyển các gen kháng bệnh mốc sương và các gen kháng bệnh virus vào khoai tây trồng. Sử dụng phân tích Flow cytometry, microsatellite và isozym để xác định các con lai khác loài. Các nguyên liệu này là nguồn tiềm năng cho việc cải biến tính di truyền và nông sinh học cho cây khoai tây. Ngoài tổ hợp các đặc tính kháng bệnh, phương pháp dung hợp tế bào trần còn để tổ hợp các đặc tính kháng các stress sinh học và phi sinh học vào cây trồng (Chen et al., 1999; Naess et al., 2000; McGrath et al., 2002).
Thieme et al. (2004) đã tạo đƣợc 500 con lai soma khác loài qua dung hợp
tế bào trần giữa các loài khoai tây dại thuộc chi Pinnatisecta và chi Etuberoa với các dòng/giống khoai tây trồng. Các loài dại S. cardiophyllum và S. tarnii có khả năng kháng với P. infestans. Các con lai soma đƣợc chọn lọc và lai lại (backcross) với khoai tây trồng. Sử dụng phương pháp test trên lá, củ; phương pháp lây nhiễm nhân tạo, cho thấy các con lai soma và các dòng con lai BC đều có khả năng kháng với bệnh mốc sương trên lá và củ.
Thieme et al. (2007) đã dung hợp thành công tổ hợp S. tarnii (2n=2x=24) và S. Etuberosum với cv. Delikat. Con lai soma tạo thành đƣợc xác định độ bội bằng máy Flowcytometry, xác nhận con lai soma heterozygote bằng kỹ thuật SSR, chỉ thị AFLP và phân tích đa hình isozym. Những cây lai soma đều biểu hiện tính kháng rất cao với dòng virus PVY và kháng nấm P. infestans rất tốt qua phản ứng siêu nhạy (HR-hypersensitive reaction). Thế hệ BC1 và BC2 cũng biểu hiện tính kháng virus và kháng nấm cao, không những vậy tính kháng này rất bền vững ở cả con lai và thế hệ BC.
Các con lai soma khác loài giữa giống khoai tây trồng Delikat với loài khoai tây dại S. tarnii lần đầu tiên đƣợc tạo ra bằng công nghệ dung hợp tế bào trần bằng xung điện (Thieme et al., 2008). Các con lai ngẫu nhiên tái sinh đƣợc chọn lọc bằng các chỉ thị phân tử (SSR, AFLP); phân tích hình thái và xác định độ bội bằng Flow cytometry. Các con lai soma chọn lọc đƣợc đã đƣợc lai lại thành công với cv.Delikat. Các dòng bố mẹ, các con lai soma, các con lai BC1 đều đƣợc kiểm tra tính kháng virus PVY bằng lây nhiễm nhân tạo, ghép với cây chỉ thị và tiếp xúc với môi giới truyền bệnh trên đồng ruộng; đồng thời chúng cũng đƣợc kiểm tra tính kháng bệnh mốc sương trên lá và trên củ. Kết quả cho thấy, các con lai soma đều không có biểu hiện bị nhiễm virus PVY và hầu hết chúng đều có khả năng kháng cao với bệnh mốc sương trên lá. Các con lai BC1 có khả năng kháng cao với virus PVY và một số ít kháng được mốc sương trên lá. Các con lai soma và con lai BC1 chọn lọc đƣợc cũng đƣợc đánh giá trên đồng ruộng về khả năng hình thành năng suất và chất lƣợng củ. Một số dòng BC1 đã hình thành củ với năng suất và chất lƣợng tốt. Các kết quả này đã khẳng định, ở con lai soma có biểu hiện đồng thời cả tính kháng virus và mốc sương; tính kháng virus được chuyển vào thế hệ BC1, nhưng tính kháng mốc sương thì rất khó chuyển. Điều này chứng tỏ rằng công nghệ lai tế bào là một công cụ đắc lực trong việc tạo các nguyên liệu đầu vào cho chọn tạo giống với độ đa dạng di truyền cao.
Thieme et al. (2010) đã tạo đƣợc các con lai không chỉ đa dạng về hình thái, các tính trạng nông sinh học mà chúng cũng đồng thời kháng đƣợc cả bệnh và sâu hại. Trước đây, các con lai soma chưa được đánh giá một cách hoàn thiện về tất cả các dữ liệu. Trong nghiên cứu này, các tác giả đã tạo đƣợc các con lai soma với đầy đủ các dữ liệu về đặc điểm hình thái, đặc tính nông sinh học, độ bội, tính kháng với virus, mốc sương và côn trùng hại CPB (Colorado potato beetles). Điểm khác biệt rõ nhất ở nghiên cứu này là các nhà nghiên cứu đã tạo ra đƣợc các con lai soma và các con lai BC mang đồng thời tính kháng bệnh virus, mốc sương và côn trùng CPB.
Để chuyển tính kháng bệnh mốc sương từ loài khoai tây dại Solanum michoacanum (mch) (có khả năng kháng bệnh mốc sương cao) vào khoai tây trồng Solanum tuberosum, các phép lai soma bằng dung hợp tế bào trần đã đƣợc áp dụng giữa mch với 2 dòng khoai tây nhị bội DG 81-68 và DG 88-89 và giống khoai tây trồng tứ bội Rynal nhạy cảm với bệnh mốc sương (Smyda et al., 2013). Tổng số có 18,775 callus đƣợc hình thành trong đó tái sinh đƣợc 1,482 chồi. Sử dụng các chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequences Repeat), CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, các tác giả đã xác định đƣợc 228 con lai khác loài và 116 con lai cùng loài (4x mch). Các con lai này đã đƣợc đánh giá về các đặc tính hình thái, khả năng ra hoa, sức sống của hạt phấn, khả năng hình thành củ và khả năng kháng bệnh mốc sương bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời.
Sau 2 vụ đánh giá các tác giả đã chọn lọc đƣợc 3 con lai soma giữa khoai tây dại mch với khoai tây trồng Solanum và 109 con lai cùng loài 4x mch có khả năng kháng bệnh mốc sương. Các dạng kháng bệnh này đồng thời có sức sống hạt phấn tốt sẽ được dùng cho các chương trình lai tạo để chuyển tính kháng bệnh từ loài dại mch vào khoai tây trồng.
Tiếp nối các nghiên cứu này, Smyda et al. (2016) đã dung chỉ thị DArT (Diversity array technology) để phân tích thành phần genom nhân của 97 con lai soma của tổ hợp lai giữa S.michoacanum với S.tuberosum và 11 con lai cùng loài 4x mch (những con lai có tính kháng bệnh mốc sương). Phân tích cấu trúc nhiễm sắc thể của các con lai đã cho thấy sự có mặt hay không có mặt của các chỉ thị phân tử từ genom của cả bố và mẹ dọc theo chiều dài của nhiễm sắc thể của các con lai soma.
2.5.3.2. Các nghiên cứu về chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương bằng phương pháp dung hợp tế bào trần ở trong nước
Mặc dù thế giới đang tiến rất nhanh và đạt đƣợc khá nhiều thành tựu trong chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh và sâu hại bằng công nghệ dung hợp tế bào trần, song ở Việt Nam, cho đến nay công nghệ này vẫn còn hết sức mới mẻ.
Một số nghiên cứu trong nước về chọn tạo giống khoai tây chống chịu bệnh mốc sương: Tại Sapa – Lào Cai (1988-1990) đã tiến hành đánh giá tính kháng bệnh mốc sương trên nguồn vật liệu do CIP cung cấp gồm 6 dòng giống BR: 2-71; 2-46; 2-88; 2-33; 2-100 vụ thu đông 1990 (Từ tháng 9 đến tháng 11), kết quả cho thấy có 3 dòng kháng ở mức độ khá với bệnh mốc sương (LBR: 2- 71; 2-46 và 2-100), thể hiện tính kháng cao hơn so với đối chứng (Đào Huy Chiên và Trịnh Văn Mỵ, 1990). Theo tác giả Phạm Xuân Tùng (1988) tại Đà Lạt, điều kiện khí hậu và tính kháng của giống là rất quan trọng đối với sự phát triển của bệnh mốc sương, ví dụ trên cùng giống khoai tây Atzimba mức độ nhiễm mốc sương mùa mưa là 5, năng suất là 6,3 tấn/ha và mùa khô là 3 và năng suất là 13,3 tấn/ha (chênh lệch 211%), giống LT-2: 238%, Giống P-006-16: 247%.
Nhƣng đối với giống kháng BR-112-113 mức độ nhiễm bệnh mùa mƣa là 4 và mùa khô là 3 tương ứng năng suất là: 14,3 và 13,1.
Bằng việc áp dụng công nghệ sinh học đánh dấu phân tử trong chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương, tháng 5 năm 2005, CIP đã cung cấp cho Trung tâm Nghiên cứu và phát triển Cây có củ (RCRDC) 32 dòng giống kháng bệnh mốc sương, trung tâm đã nghiên cứu đánh giá các dòng giống trên ở các vùng sinh thái đồng bằng (tại Thanh trì- Hà nội) và vùng cao phía bắc (tại Tân lạc và Đà bắc thuộc tỉnh Hoà bình.
Như vậy hướng nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây lâu nay ở Việt Nam chủ yếu vẫn là công tác nhập nội và khảo nghiệm, trên cơ sở đó đề xuất các giống phù hợp cho sản xuất. Cùng với những tiến bộ và thành tựu đạt đƣợc của thế giới trong nghiên cứu cải tạo giống cây trồng bằng dung hợp tế bào trần, Việt Nam đang dần kế thừa và bắt đầu nghiên cứu kỹ thuật dung hợp tế bào trần tạo giống khoai tây kháng virus và bệnh cũng nhƣ một số dịch hại nguy hiểm khác.
Ở Việt Nam hướng nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây có sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần đã được bắt đầu tiến hành. Nguyễn Thị Phương Thảo và cs. (2009) đã thu thập, đánh giá một số dòng khoai tây nhị bội về đặc tính nông sinh học và đặc tính kháng virus. Nhóm tác giả trên cũng đã dung hợp
thành công giữa các dòng khoai tây nhị bội tạo ra các con lai soma tứ bội. Trong số các con lai soma tứ bội tạo ra đã chọn lọc đƣợc 02 dòng con lai triển vọng mang khả năng kháng bệnh virus PVY và mang các đặc tính nông sinh học quý đang được phát triển thành giống sản xuất thử (Nguyễn Thị Phương Thảo và cs., 2011a, 2011b; 2012; Đỗ Thị Thu Hà và cs., 2012; Đinh Thị Thu Lê và cs., 2012;
Vũ Thị thu hằng và cs., 2012). Tiếp tục hướng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tạo các con lai soma tổ hợp đƣợc đặc tính kháng bệnh mốc sương từ loài dại và các đặc tính nông học quý từ khoai tây trồng. Đây là hướng đi quan trọng để tạo vật liệu khởi đầu cho chương trình chọn tạo giống khoai tây của Việt Nam.