PBS (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Kháng nguyên (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Hồng cầu (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Độ pha loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2028 Đọc kết quả:
Dương tính: xảy ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu. Âm tính: hồng cầu tụ lại thành cụm tròn nhỏ ở đáy giếng.
Hiệu giá của kháng nguyên (một đơn vị kháng nguyên) là độ pha loãng cao nhất có 100% hồng cầu gà ngưng kết.
3.5.3 Qui trình thực hiện phản ứng HI
- Nguyên lý
Khi cho huyết thanh có kháng thể kháng virus có khả năng ngưng kết hồng cầu tương ứng thì sau một thời gian virus sẽ bị trung hòa và mất khả năng ngưng kết hồng cầu.
Trong phản ứng này người ta sử dụng lượng kháng nguyên nhất định, còn huyết thanh được pha loãng cho đến khi lượng kháng thể có trong huyết thanh không còn đủ khả năng ngăn trở hiện tượng ngưng kết hồng cầu.
- Chuẩn bị kháng nguyên 4 đơn vị để làm phản ứng HI
Giả sử hiệu giá của kháng nguyên một đơn vị là 1/256 thì kháng nguyên bốn đơn vị sẽ có hiệu giá là 1/64.
Pha kháng nguyên bốn đơn vị như sau: lấy 1 ml của kháng nguyên + 63 ml của nước muối sinh lý.
Tiến hành chuẩn độ lại kháng nguyên để xác định xem kháng nguyên mới pha để chuẩn bị làm phản ứng HI có đúng là kháng nguyên bốn đơn vị chưa.
Cách tiến hành tương tự như phản ứng HA và giếng ngưng kết cao nhất là giếng thứ hai, sau đó tiến hành phản ứng HI.
- Thành phần phản ứng
Dung dịch PBS.
Huyết thanh gà thí nghiệm.
Kháng nguyên có 4 đơn vị ngưng kết pha loãng trong dung dịch PBS. Hồng cầu gà 0.5%
- Tiến hành phản ứng HI
Cho 50 µl PBS vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng 96 giếng.
Cho 50 µl huyết thanh đã được hấp phụ vào các giếng của hai hàng A và B của đĩa phản ứng (hàng A làm đối chứng huyết thanh, hàng B làm phản ứng).
Dùng micropipette pha loãng mẫu huyết thanh bắt đầu từ hàng B đến hàng H với thể tích là 50 µl, loại bỏ 50 µl sau khi pha loãng đến hàng cuối cùng của đĩa phản ứng. Cho 50 µl kháng nguyên bốn đơn vị vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, trừ hàng đối chứng huyết thanh (hàng A).
Lắc đều, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng thể hiện diện trong huyết thanh liên kết với kháng nguyên.
Cho 50 µl hồng cầu gà 0.5 % vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng. Sau 15 phút tiến hành đọc kết quả.
Đọc kết quả
Phản ứng dương tính: khi hồng cầu tụ thành chấm đỏ ở dưới đáy giếng, giếng đối chứng hồng cầu. Hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle trong mẫu huyết thanh là độ pha loãng cao nhất của mẫu huyết thanh có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu gà 100%.
Dương tính ở giếng thứ 1 tương ứng với hiệu giá 1/2 Dương tính ở giếng thứ 2 tương ứng với hiệu giá 1/4 ………
Phản ứng âm tính: hồng cầu xuất hiện từng cụm ngưng kết ở đáy giếng.
♦ Tiêu chí đánh giá: Hiệu giá HI ≥ 1/16 (4log2) được coi là hiệu giá bảo hộ của cá thể
gia cầm; đàn gia cầm được bảo hộ là đàn có ≥ 70% số cá thể có hiệu giá HI ≥ 1/16 (4log2).
Bảng 3.4 Trình tự tiến hành thực hiện phản ứng HI Số giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11