- K.T.G của phân viện thú y Miền Trung
+ Đặc tính kỹ thuật
Kháng thể Newcastle và Gumboro là sinh phẩm thú y được sản xuất từ lòng đỏ trứng gà chứa kháng thể kháng virus Newcastle, Gumboro và viêm phế quản truyền nhiễm. Sinh phẩm có tính ổn định cao về an toàn và hiệu lực.
+ Chỉ định
Dùng để phòng và trị bệnh Newcastle, Gumboro và viêm phế quản truyền nhiễm cho gà ở mọi lứa tuổi.
+ Thành phần
Kháng thể Newcastle (hiệu giá HI ≥ 9 log2) Kháng thể Gumboro (hiệu giá AGP ≥ 4log2)
Kháng thể viêm phế quản truyền nhiễm (chỉ số S/P ≥ 0.85) + Cách sử dụng
Để chai kháng thể ở nhiệt độ phòng cho đến khi trở lại dạng lỏng bình thường, lắc đều trước khi dùng và sử dụng ngay trong ngày.
Tiêm bắp.
Điều trị bệnh: Gà dưới 2 tháng tuổi tiêm 1ml/con/lần. Gà trên 2 tháng tuổi tiêm 2ml/con/lần. Tiêm hai lần, mỗi lần cách nhau 3 ngày. Phòng bệnh: bằng nửa liều điều trị (tiêm một lần duy nhất).
+ Quy cách sản phẩm
Sản phẩm được đóng chai 50ml và 100ml + Bảo quản:
Từ 50C đến 100C: bảo quản được 3 tháng. Từ -100C đến 00C: bảo quản được 5 tháng.
Chú ý: Bơm tiêm và kim tiêm phải được tiệt trùng trước và sau khi tiêm (không được tiệt trùng bằng hóa chất). Không sử dụng sinh phẩm quá hạn.
- Chế phẩm K.T.G của Hanvet + Thành phần Trong lọ kháng thể chứa: Kháng thể Newcastle Kháng thể Gumboro Kháng thể IB Các kháng thể không đặc hiệu khác. + Chỉ định
Phòng và chữa bệnh Newcastle, Gumboro, IB, CRD.
Tác dụng như protein liệu pháp, nâng cao sức đề kháng không đặc hiệu cho gia cầm chống lại nhiều bệnh gây ra do virus, vi khuẩn.
+ Liều lượng và cách dùng Phòng bệnh:
Lần 1: 0.5 – 1 ml/con vào ngày thứ 15 – 20 Lần 2: 1 – 2 ml/con vào ngày thứ 25 – 30
Chữa bệnh:
Dưới 500 g: 1 ml/con. Trên 500 g: 2ml/con. + Đặc điểm của kháng thể
Kháng thể chống được virus, chống được cả độc tố
Kháng thể cung cấp miễn dịch nhanh chống trong vài giờ, dùng phòng bệnh khẩn cấp
Khi cần đến ở vùng đang có dịch, dùng điều trị bệnh cấp tính có hiệu quả tức thì Kháng thể thụ động có hiệu quả kéo dài đến 2 tuần lễ
Kháng thể tác động đặc hiệu mầm bệnh, không tác động lan tràn ngoài ý muốn. Kháng thể không gây kháng thuốc nên không gây hậu quả cho hệ sinh thái môi trường.
Kháng thể ngoài tác dụng phòng trị bệnh đặc hiệu, còn có tác d ụng như một protein liệu pháp, giúp con vật sau khi sử dụng tăng trưởng tốt hơn.
Quy trình sản xuất kháng thể gồm các bước: miễn dịch cơ sở, tối miễn dịch cho động vật, thu kháng thể, chế tạo thành sản phẩm.
CHƯƠNG III
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Nội dung nghiên cứu
- Bố trí thí nghiệm để đánh giá hiệu quả phòng bệnh của kháng thể thụ động K.T.G và vaccine thông qua hàm lượng kháng thể trong máu gà.
3.2 Phương tiện thí nghiệm
3.2.1 Địa điểm
- Gà thí nghiệm được nuôi tại huyện Phụng Hiệp tỉnh Hậu Giang.
- Các mẫu huyết thanh của gà được xét nghiệm tại phòng thí nghiệm Vi Sinh-Miễn Dịch Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.
3.2.2 Thời gian
- Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 01/2012 đến tháng 07/2012.
3.2.3 Đối tượng nghiên cứu
- Gà nuôi thí nghiệm: gà từ 1 ngày tuổi được chọn từ những đàn gà bố mẹ khỏe mạnh. Gà con có trọng lượng tương đối đồng đều nhau, số lượng trống mái ở mỗi lô theo quá trình ngẫu nhiên của giống và gà được xét nghiệm hàm lượng kháng thể kháng virus Newcastle để đảm bảo tính đồng đều của các lô thí nghiệm.
Tổng số lượng gà thí nghiệm là 270 con, 90 con cho một giống. Trong thí nghiệm chúng tôi sử dụng 3 giống gà: 2 giống gà bản địa (gà Nòi, gà Tàu) và gà Lương Phượng có xuất xứ từ Trung Quốc.
3.3 Hóa chất
- Vaccine virus Newcastle (Lasota) của công ty Navetco - Dung dịch chống đông Alsever
- Kháng thể K.T.G của công ty Hanvet 3.4 Dụng cụ thí nghiệm - Tủ đông - Tủ ấm - Nồi hấp autoclave - Máy ly tâm
- Đĩa microplate 96 giếng đáy chữ U - Micropipette - Ống nghiệm Hình 3.1: Vaccine Newcastle chủng lasota (Nguồn:http://www.navetco.com.vn) Hình 3.2: Kháng thể K.T.G
3.5 Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Bố trí thí nghiệm và đánh giá khả năng bảo hộ của vaccine Newcastle (chủng lasota), K.T.G lasota), K.T.G
- Chăm sóc nuôi dưỡng gà
♦ Kỹ thuật úm gà con
Vệ sinh và sát trùng chuồng úm, máng ăn, máng uống 5-7 ngày trước khi nuôi. Lót sàn bằng giấy báo suốt 3 ngày đầu, và thay giấy mỗi ngày một lần.
Sưởi ấm: dùng một bóng đèn 75w cho 1m2 chuồng úm, trong suốt tuần đầu. Có treo nhiệt kế để theo dõi sự biến động nhiệt độ chuồng úm.
Điều chỉnh nhiệt sưởi ấm: khi quá mức nóng (thấy gà con tản ra xa đèn sưởi và thở mạnh), thì nâng cao hoặc bỏ bớt đèn sưởi. Nếu quá lạnh (gà con tụ lại thành đống dưới đèn sưởi), thì hạ thấp đèn. Khi nhiệt độ sưởi vừ a đủ, gà con tản đều. Sau 2 tuần, chỉ cần đèn chiếu sáng (để gà ăn ban đêm).
Cung cấp nước uống ngay từ ngày đầu.
Từ tuần thứ 4 gà không còn nuôi úm, cho ăn uống bình thường, vệ sinh tốt c huồng trại. Gà được cho ăn uống tự do, sử dụng thức ăn của công ty De Heus, bổ sung thêm vitamin C.
♦ Mật độ nuôi
1 ngày đến 2 tuần tuổi: 50 con/m2 2 tuần đến 3 tuần tuổi: 35 con/m2 3 tuần đến 4 tuần tuổi: 30 con/m2 4 tuần đến 5 tuần tuổi: 25 con/m2 5 tuần đến 6 tuần tuổi: 20 con/m2 6 tuần đến 7 tuần tuổi: 15 con/m2
7 tuần tuổi đến xuất bán: 10 con/m2
♦ Quy trình phòng bệnh chung
Quy trình phòng bệnh được tóm tắt qua bảng 3.1
Bảng 3.1 Quy trình phòng bệnh bằng vaccine
Sử dụng kháng thể K.T.G thay cho vaccine và các ngày tuổi 7 và 21
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm với vaccine Newcastle, K.T.G trên 3 giống gà.
Giống gà VACCINE KTG Đối chứng Tổng số
Gà Nòi 30 30 30 90
Gà Tàu 30 30 30 90
Gà Lương Phượng 30 30 30 90
Tổng 90 90 90 270
♦ Mô tả nghiệm thức
Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần đối với từng giống gà (mỗi lô 10 gà). Thí nghiệm được thực hiện trên 3 giống gà (gà Nòi, gà Tàu, gà Lương Phượng), mỗi giống 90 con. Tổng số 270 con.
Ngày tuổi Tên vaccine Tên công ty Cách tiêm ngừa
7 10 15 21 45 60 120 165 Lasota + Gumboro Đậu Cúm gia cầm Lasota + Gumboro Cúm gia cầm Tụ huyết trùng Newcastle chủng M Newcastle chủng M Navetco Navetco Navetco Navetco Navetco Navetco Navetco Navetco Nhỏ mắt mũi Chủng qua cánh Tiêm dưới da cổ Nhỏ mắt mũi Tiêm dưới da cổ Tiêm dưới da cổ Tiêm bắp Tiêm bắp
♦ Quy trình tiêm phòng như sau
Đối với lô gà thí nghiệm dùng vaccine (lasota), kháng thể K.T.G để chủng ngừa bệnh Newcastle thực hiện 2 lần.
Lần 1: khi gà 7 ngày tuổi, nhỏ mắt mũi Lần 2: khi gà 21 ngày tuổi, nhỏ mắt mũi
Đối với lô gà đối chứng thì không sử dụng vaccine và kháng thể K.T.G Các lô gà thí nghiệm được chăm sóc nuôi dưỡng theo quy trình giống nhau
Để đánh giá khả năng bảo hộ của vaccine Newcastle (chủng lasota), kháng thể K.T.G đối với một số giống gà thả vườn bản địa và ngoại nhập nuôi thịt, chúng tôi lấy máu thực hiện phản ứng HA, HI.
Lấy máu tim lần 1 lúc gà 1-3 ngày tuổi để kiểm tra kháng thể thụ động. Lấy máu tĩnh mạch cánh lần 2 lúc gà 35 ngày tuổi (sau 2 tuần khi tiêm vaccine lần 2), lần 3 lúc 49 ngày tuổi và lần 4 vào giai đoạn xuất bán (2,5 tháng đối với gà Lương Phượng và 3 tháng tuổi đối với gà Tàu và gà Nòi), để kiểm tra đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng. Tương tự lấy máu ở các thời điểm trên đối với lô đối chứng.
♦ Phương pháp lấy máu để kiểm tra kháng thể trong lô gà thí nghiệm.
- Mỗi con lấy khoảng 0,5 ml máu cho vào ống nghiệm vô trùng, ghi lại ký hiệu của gà thí nghiệm. Đặt ống nghiệm nằm nghiêng cho máu đông đễ lấy huyết thanh.
- Bảo quản mẫu
Máu sau khi lấy sẽ được trữ ở 40C trong thùng trữ mẫu rồi chuyển đến phòng thí nghiệm, chắt lấy huyết thanh cho vào ống typ, trữ trong tủ lạnh ở -200C chờ xét nghiệm.
3.5.2 Qui trình thực hiện phản ứng HA
- Nguyên lý
Virus Newcastle có khả năng ngưng kết hồng cầu. Khi hồng cầu được rửa sạch bằng PBS sẽ bộc lộ ra những thụ thể bề mặt và virus Newcastle sẽ kết hợp với hồng cầu qua những thụ thể này.
Đây là đặc điểm quan trọng để xác định một cách gián tiếp sự hiện diện của virus nhằm định lượng và chuẩn độ kháng nguyên virus Newcastle dùng cho phản ứng HI.
- Chuẩn bị hồng cầu gà 10% và 0.5%
Chọn 2 – 3 con gà khoẻ, lấy máu khoảng 4 – 5 ml có chất kháng đông (Alsever).
Thêm một lượng tương đương dung dịch nước muối sinh lý vào phần máu vừa lấy, lắc đều.
Ly tâm ở 2000 vòng trong 10 phút, loại bỏ phần nước phía trên. Ly tâm lặp lại từ 2-3 lần.
Dùng Hematocrit để đo tỷ lệ hồng cầu sau khi đã được rửa sạch. Pha hồng cầu 10 % theo công thức C1V1 = C2V2.
C1: nồng độ hồng cầu gốc. V1: thể tích hồng cầu gốc. C2: nồng độ hồng cầu cần pha. V2: thể tích hồng cầu cần pha.
Từ hồng cầu 10 % pha hồng cầu 0,5 % theo công thức trên để làm phản ứng.
- Thành phần phản ứng
Kháng nguyên là vaccine chủng Lasota được pha trong dung dịch đệm PBS. Dung dịch PBS.
- Tiến hành phản ứng HA
Cho 50 µl PBS vào hai hàng A và B của đĩa phản ứng 96 giếng.
Cho 50 µl kháng nguyên vào giếng A1 và B1. Dùng micropipette trộn đều sau đó pha loãng dần từ giếng A1, B1 cho đến giếng A12, B12 với thể tích là 50 µl, loại bỏ 50 µl dung dịch sau khi pha loãng đến giếng cuối cùng.
Thêm 50 µl hồng cầu gà 0,5 % vào tất cả các giếng, để yên sau 15 phút.
Bảng 3.3 Trình tự tiến hành thực hiện phản ứng HA Số giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Số giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 PBS (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Kháng nguyên (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Hồng cầu (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Độ pha loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2028 Đọc kết quả:
Dương tính: xảy ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu. Âm tính: hồng cầu tụ lại thành cụm tròn nhỏ ở đáy giếng.
Hiệu giá của kháng nguyên (một đơn vị kháng nguyên) là độ pha loãng cao nhất có 100% hồng cầu gà ngưng kết.
3.5.3 Qui trình thực hiện phản ứng HI
- Nguyên lý
Khi cho huyết thanh có kháng thể kháng virus có khả năng ngưng kết hồng cầu tương ứng thì sau một thời gian virus sẽ bị trung hòa và mất khả năng ngưng kết hồng cầu.
Trong phản ứng này người ta sử dụng lượng kháng nguyên nhất định, còn huyết thanh được pha loãng cho đến khi lượng kháng thể có trong huyết thanh không còn đủ khả năng ngăn trở hiện tượng ngưng kết hồng cầu.
- Chuẩn bị kháng nguyên 4 đơn vị để làm phản ứng HI
Giả sử hiệu giá của kháng nguyên một đơn vị là 1/256 thì kháng nguyên bốn đơn vị sẽ có hiệu giá là 1/64.
Pha kháng nguyên bốn đơn vị như sau: lấy 1 ml của kháng nguyên + 63 ml của nước muối sinh lý.
Tiến hành chuẩn độ lại kháng nguyên để xác định xem kháng nguyên mới pha để chuẩn bị làm phản ứng HI có đúng là kháng nguyên bốn đơn vị chưa.
Cách tiến hành tương tự như phản ứng HA và giếng ngưng kết cao nhất là giếng thứ hai, sau đó tiến hành phản ứng HI.
- Thành phần phản ứng
Dung dịch PBS.
Huyết thanh gà thí nghiệm.
Kháng nguyên có 4 đơn vị ngưng kết pha loãng trong dung dịch PBS. Hồng cầu gà 0.5%
- Tiến hành phản ứng HI
Cho 50 µl PBS vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng 96 giếng.
Cho 50 µl huyết thanh đã được hấp phụ vào các giếng của hai hàng A và B của đĩa phản ứng (hàng A làm đối chứng huyết thanh, hàng B làm phản ứng).
Dùng micropipette pha loãng mẫu huyết thanh bắt đầu từ hàng B đến hàng H với thể tích là 50 µl, loại bỏ 50 µl sau khi pha loãng đến hàng cuối cùng của đĩa phản ứng. Cho 50 µl kháng nguyên bốn đơn vị vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, trừ hàng đối chứng huyết thanh (hàng A).
Lắc đều, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng thể hiện diện trong huyết thanh liên kết với kháng nguyên.
Cho 50 µl hồng cầu gà 0.5 % vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng. Sau 15 phút tiến hành đọc kết quả.
Đọc kết quả
Phản ứng dương tính: khi hồng cầu tụ thành chấm đỏ ở dưới đáy giếng, giếng đối chứng hồng cầu. Hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle trong mẫu huyết thanh là độ pha loãng cao nhất của mẫu huyết thanh có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu gà 100%.
Dương tính ở giếng thứ 1 tương ứng với hiệu giá 1/2 Dương tính ở giếng thứ 2 tương ứng với hiệu giá 1/4 ………
Phản ứng âm tính: hồng cầu xuất hiện từng cụm ngưng kết ở đáy giếng.
♦ Tiêu chí đánh giá: Hiệu giá HI ≥ 1/16 (4log2) được coi là hiệu giá bảo hộ của cá thể
gia cầm; đàn gia cầm được bảo hộ là đàn có ≥ 70% số cá thể có hiệu giá HI ≥ 1/16 (4log2).
Bảng 3.4 Trình tự tiến hành thực hiện phản ứng HI Số giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Số giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 PBS (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Huyết thanh (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Kháng nguyên (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Hồng cầu (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Độ pha loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2028 3.6 Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel để tính các tỷ lệ và so sánh các tỷ lệ bằng phương pháp Chi-Square Test với phần mềm Minitab 13.
CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả kháng thể thụ động trên gà con một ngày tuổi
Bảng 4.1 Kết quả kháng thể thụ động trên gà con 1 ngày tuổi giữa các giống gà (n=10 gà/giống) gà/giống)
Giống gà Hiệu giá kháng thể (x log2) <4 4 5 6 7 8 9 Số mẫu ≥ 4log2 Tỷ lệ bảo hộ (%) Gà Nòi 4 4 2 0 0 0 0 6 60,00 Gà Tàu 5 4 1 0 0 0 0 5 50,00 Gà Lương Phượng 5 4 1 0 0 0 0 5 50,00
Kết quả bảng 4.5, ta thấy kháng thể thụ động trên gà con 1 ngày tuổi ở giống gà Nòi là 60,00% so với giống gà Tàu và gà Lương Phượng là 50,00%. Kháng thể thụ động từ mẹ truyền sang gà con trên 3 giống gà khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p=0.875). Kháng thể thụ động từ mẹ truyền sang con quyết định đến việc phòng chống bệnh Newcatle, bảo vệ gà con trong giai đoạn đầu. Nếu đàn gà mẹ được miễn dịch chắc chắn thì gà con nở ra có hàm lượng kháng thể ngang bằng lượng kháng thể trong máu gà mẹ. Kháng thể tồn tại ở gà con từ 20–30 ngày. Thông thường lượng kháng thể mẹ truyền hết hẳn vào ngày thứ 28. Nếu gà mẹ nhiễm virus cường độc ngoài tự nhiên thì kháng thể mẹ truyền có thể tồn tại đến ngày thứ 45, cũng như đáp ứng miễn dịch với các bệnh