Trong nghiên cứu sinh học phân tử virus cúm A/H5N1, chúng tôi sử dụng phản ứng RT-PCR một bước (QIAGEN). Thành phần phản ứng và các chu trình nhiệt lần lượt được trình bàyở Bảng 2.1 và Bảng 2.2.
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng RT-PCR Thành phần phản ứng Thể tích(µl)
QIAGEN-onestep RT-PCR 5X 10
dNTP mix (10mMol/µl) 2
Enzym mix 2
Mồi xuôi (10pMol/µl) 2
Mồi ngược (10pMol/µl) 2
RNA tổng số 2
Nước tinh khiết 30
Bảng 2.2: Chu trình nhiệt sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử virus cúm A/H5N1
Phân đoạn
gen Chu trình nhi
ệt Phân đoạn
gen Chu trình nhi
ệt
PB2 NP
PB1 NA
PA M
Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR và sơ đồ bố trí mồi để thu nhận các phân đoạn gen được trình bày ở Bảng 2.3 vàHình 2.2.
Bảng 2.3: Danh sách mồi sử dụng để thu nhận hệ gen virus cúm gia cầm
TT Tên mồi Trình tự mồi (5’ 3’) Mô tả Ghi chú
1 PB2F CAGGTCAAATATATTCAATATGGAG Mồi xuôi Thu nhận gen PB2
2 PB2R1 CCICCAAAISTGAAGGATGA Mồi ngược Thu nhận gen PB2
3 PB2F3 5'- AAAGCAGCAATGGGTCTG -3' Mồi xuôi Thu nhận gen PB2
4 PB2R CTAATTGATGGCCATCCG Mồi ngược Thu nhận gen PB2
5 PB1F1 TTGAATGGATGTCAATCCGA Mồi xuôi Thu nhận gen PB1
6 PB1R2 CATCGGTATGTGTATCTGTAGTCC Mồi ngược Thu nhận gen PB1
7 PB1F3 TGAGCATTGGTGTTACAGTG Mồi xuôi Thu nhận gen PB1
8 PB1R3 AGTAGAAACAAGGCATTTTTT Mồi ngược Thu nhận gen PB1
9 PAF AAGAWTTTGTGCGACAATGCT Mồi xuôi Thu nhận gen PA
10 PAR GACATTTGAGAAAGCTTGCC Mồi ngược Thu nhận gen PA
11 PAF2 TTGTCTCTTCGCCTCTCTCG Mồi xuôi Thu nhận gen PA
12 PAR2 GATTGAAGAAGGCATCGC Mồi ngược Thu nhận gen PA
13 PAF3 ACCAAAGAAGGAAGACGG Mồi xuôi Thu nhận gen PA
14 PB1R3 AGTAGAAACAAGGCATTTTTT Mồi ngược Thu nhận gen PA
15 H5BAMF CGGGATCCTCTGTCAAAATGGAGAA
AATAGTGCTT
Mồi xuôi, có điểm
cắt của enzym
BamHI GGATCC
Thu nhận gen H5
16 H5NOTR ATAAGAATGCGGCCGCTCATTAAATG
CAAATTCTGCATTGTAACGA
Mồi ngược, có điểm
cắt của enzymNotI GCGGCCGC
Thu nhận gen H5
17 NPF ATGGCGTCTCAAGGCACC Mồi xuôi Thu nhận gen NP
18 NPR TTAATTGTCATACTCCTCTGC Mồi ngược Thu nhận gen NP
19 N1ECOF CCGGAATTCAAAATGAATCCAAATCA
GAAGATAATAACCATT Mồi xuôi Thu nhận gen N1
20 N1NOTR ATAAGAATGCGGCCGCTCACTACTTG
TCAATGGTGAATGGCAA Mồi ngược Thu nhận gen N1
21 MAF ATGAGTCTTCTAACCGAGGTC Mồi xuôi Thu nhận gen M
22 MAR GAAACAAGGTAGTTTTTTACTCC Mồi ngược Thu nhận gen M
23 NSF1 AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACA Mồi xuôi Thu nhận gen NS
2.5.3 Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT-PCR
Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên thạch agarose 1%. Chỉ thị DNA sử dụng trong nghiên cứu là DNA thực khuẩn thể Lamda, có kích thước 43 kb, được cắt bằng enzym giới hạn HindIII. DNA của thực khuẩn
thể Lamda được HindIII cắt thành 8 phân đoạn có độ dài: 23,1 kb; 9,4 kb; 6,5
kb; 4,3 kb; 2,3 kb; 2,0 kb; 0,564 kb và 0,125 kb. Độ dài của đoạn sản phẩm RT- PCR có thể xác định được khi đối chiếu với chỉ thị phân tử.
Kiểm tra sản phẩm RT-PCR được thực hiện ở các bước sau: - Chuẩn bị thạch agarose 1%.
- Dìm ngập khay có thạch trong hộp điện di chứa đệm TAE 1 lần.
- Tra mẫu: lấy 5 µl sản phẩm trộn với chỉ thị màu (loading dye - thường là xanh Bromophenol và Glycerol) và tra vào từng giếng trong thạch.
- Tra chỉ thị phân tử: lấy 10 µl (0,5 µg) chỉ thị phân tử (DNA marker) cho vào 1 giếng riêng biệt khác.
- Thực hiện điện di ở 100-120V, 400 mA trong 25-30 phút. - Rửa thạch bằng nước cất, soi qua tia cực tím và chụp ảnh.
2.5.4 Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR
Sản phẩm RT-PCR được tinh sạch bằng bộ QIAquick PCR purification kit (QIAGEN), như sau:
- Thêm 200 µl PB vào 40 µl sản phẩm, trộn đều.
- Chuyển cột, ly tâm 13.000 vòng/1 phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới. - Thêm 750 µl PE, ly tâm 13.000 vòng/1 phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới. - Ly tâm tiếp 13.000 vòng/1 phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới.
- Chuyển cột sang ống Eppendorf mới.
- Thêm 30 µl EB, ly tâm 13.000 vòng/1 phút trong 1 phút. Thu nhận sản phẩm PCR tinh sạch, ký hiệu mẫu và giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng.
2.5.5 Phương pháp dòng hóa
2.5.5.1 Nối sản phẩm RT-PCR vào plasmid vector
Do sản phẩm PCR/RT-PCR (sử dụng enzym Taq DNA polymerase xúc tác tổng hợp) thường được gắn thêm Adenine (A)ở đầu 3’, nên khi nối với vector có đầu lồi là Thymine (T) đã được các hãng sinh phẩm thiết kế từ trước, thì hai nucleotide này sẽ gắn nối bổ sung cho nhau nhờ enzym nối T4-DNA ligase hoặc enzym topoisomerase.
Các vector thường được sử dụng để nối ghép (ligation) sản phẩm PCR/RT- PCR vào vector là pCR2.1 hay pCR2.1TOPO (Invitrogen) (Hình 2.3).
pCR®2.1-TOPO® 3931 nucleotides
Thành phần phản ứng:
Vector pCR2.1TOPO: 1 µl
Nước tinh khiết: 2 µl
Sản phẩm PCR: 2 µl
Dung dịch muối: 1 µl
Tổng số: 6 µl
Giữ ở nhiệt độ 25oC trong 10 phút. Chuyển nạp và nuôi cấy trên môi trường thạch LB có chứa kháng sinh và X-gal.
Các bước tiến hành:
- Lấy 3 µl sản phẩm của phản ứng nối-ghép, chuyển vào ống chứa 50 µl tế bào khả biến.
- Ủ trên đá trong 45 phút, xử lý nhiệt (heat-shock) ở 420C trong 45 giây, ngay lập tức chuyển vào trong đá và để 2 phút.
- Thêm 150 µl SOC (dung dịch giàu dinh dưỡng), lắc 200 vòng/phútở 370C trong 1 giờ 30 phút.
- Toàn bộ hỗn hợp được dàn trên mặt thạch LB 1,5% có chứa kháng sinh Kanamycin (hoặc Ampicillin) và X-gal,ủ ở tủ ấm 370C trong 18-20 giờ.
- Sau khi ủ 18 - 20 giờ, nếu có khuẩn lạc phát triển trên mặt thạch, thìđưa đĩa thạch vào ngăn lạnh (10oC) trong tủ lạnh để X-gal phân giải hoàn toàn, giúp nhận biết dễ dàng khuẩn lạc trắng và xanh trong quá trình chọn lọc khuẩn lạc.
2.5.5.2 Chọn lọc khuẩn lạc và nuôi cấy trong môi trường lỏng
- Khuẩn lạc màu trắng (tốt nhất là màu trắng ngà) trên môi trường thạch LB được lựa chọn để nuôi cấy trong môi trường LB lỏng.
- Bổ sung 10 µl Kanamycin (50mg/ml) để chọn lọc dòng vi khuẩn có mang gen kháng kháng sinh.
- Bổ sung thêm 7 µl X-gal (40mg/ml) vào môi trường để phân biệt ống môi trường có vi khuẩn tái tổ hợp phát triển (không có màu xanh) với ống có vi khuẩn không tái tổ hợp (có màu xanh) mà khi chọn lọc khuẩn lạc bị lẫn tạp hoặc khi chọn lọc khuẩn lạc có nhân khuẩn lạc màu hơi xanh chưa phân biệt được.
- Sau khi cấy khuẩn lạc, ống môi trường được lắc với tần số 220 lần/phút trong 16-20 giờ ở 370C cho vi khuẩn nhân lên.
2.5.5.3 Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp
Quá trình tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp bằng bộ kit QIAprep Spin Miniprep của hãng QIAGENđược thực hiện theo các bước như sau:
- Lấy 1,5 ml dung dịch tế bào vi khuẩn tái tổ hợp đãđược nuôi cấy qua đêm cho vàoống Eppendorf (trước khi lấy cần lắc nhẹ ống nuôi cấy vi khuẩn cho đều).
- Ly tâm 10.000 - 13.000 vòng/phút trong 4-5 phút để thu lấy tế bào, bỏ môi trường bên trên, giữ lại cặn tế bào bên dưới.
- Thêm 250 µl dung dịch P1 vàoống có chứa cặn tế bào để hòa tan cặn, dùng pipet hút nhẹ nhàng lên xuống vài lần cho đều phần cặn trong dung dịch.
- Bổ sung 250 µl dung dịch P2 vàoống Eppendorf chứa tế bào trên để ly giải tế bào, lắc ống vài lần, để ở nhiệt độ phòng trong 3 -4 phút (không quá 5 phút).
- Thêm 350 µl dung dịch N3, trộn toàn bộ ống bằng cách lắc xuôi-ngược ống vài lần, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. D NA của plasmid tái tổ hợp có trong phần dịch ở trên. Lớp cặn kết tủa màu trắng bám dọc theo thànhống gồm các thành phần hữu hình tế bào, các loại muối vô cơ và nhiều thành phần khác.
- Chuyển toàn bộ phần dịch bên trên (khoảng 800 µl) lên bề mặt màng của cột lọc đặt trong 1 ống hứng (collection tube). Khi chuyển không được động đến cặn tủa màu trắng bám dọc theo thành ống.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới. DNA của plasmid tái tổ hợp mang điện tích âm được giữ lại trong màng lọc the o cơ chế liên kết tích điện.
- Thêm 500 µl dung dịch PB lên trên màng lọc để rửa màng lọc có DNA của plasmid.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch bên dưới.
- Thêm 750 µl dung dịch PE lên trên màng lọc để tiếp tục rửa màng lọc. - Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch bên dưới.
A. Gen HA (H5)
Số đăng
LOCUS EF051513 1733 bp DNA linear SYN 19-NOV-2006 DEFINITION Synthetic construct hemagglutinin gene, complete cds.
ACCESSION EF051513
VERSION EF051513.1 GI:117958996 KEYWORDS .
SOURCE synthetic construct ORGANISM synthetic construct
other sequences; artificial sequences. REFERENCE 1 (bases 1 to 1733)
AUTHORS Tran,Q.V., Nguyen,B.T., Le,T.H., Nguyen,B.N., Nong,V.H., Dinh,D.K., Phan,V.C., Le,T.B. and Nguyen,B.H.
TITLE Molecular characterization of H5N1 isolates in Vietnam for evolution/pathogenicity/antigenic compatibility using H5 sequences as markers
JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1733)
AUTHORS Tran,Q.V., Nguyen,B.T. and Le,T.H. TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (08-OCT-2006) Immunology Department, Institute of Biotechnology, Hoang Quoc Viet Rd, Hanoi 10000, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1733
/organism="synthetic construct" /mol_type="other DNA"
/db_xref="taxon:32630"
/PCR_primers="fwd_name: H5BAMF, fwd_seq:
ccgggatcctctgtcaaaatggagaaaatagtgctt, rev_name: H5NOTR, rev_seq: ataagaatgcggccgctcattaaatgcaaattctgca" /note="derived from Influenza A virus
(A/chicken/Vietnam/HG4/2005(H5N1))" CDS 16..1722 /codon_start=1 /transl_table=11 /product="hemagglutinin" /protein_id="ABK58581.1" /db_xref="GI:117958997" /translation="MEKIVLLFAIFSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTH AQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPV NDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFF RNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVMWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGT STLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRIEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKRG DSTIMKSELEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSTRLVLATGLR NSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAID GVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMEN ERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQY SEEVRLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRI CI" ORIGIN
1 ggatcctctg tcaaaatgga gaaaatagtg cttctttttg cgatattcag tcttgttaaa 61 agtgatcaga tttgcattgg ttaccatgca aacaactcaa cagagcaggt tgacacaata 121 atggaaaaga acgttactgt tacacatgcc caagacatac tggaaaagac acacaacggg 181 aagctctgcg atctagatgg agtgaagcct ctaattttga gagattgtag tgtagctgga 241 tggctcctcg gaaacccaat gtgtgacgag ttcatcaatg tgccggaatg gtcttacata 301 gtggagaagg ccaatccagt caatgacctc tgttacccag gggatttcaa tgactatgaa 361 gaattgaaac acctattgag cagaataaac cattttgaga aaattcagat catccccaaa 421 agttcttggt ccagtcatga agcctcgtta ggagtgagct cagcatgtcc ataccaggga 481 aagtcctcct ttttcagaaa tgtggtatgg cttatcaaaa agaacagtac atacccaaca 541 ataaagagga gctacaataa taccaaccaa gaagatcttt tggtaatgtg ggggattcac 601 catcctaatg atgcggcaga gcagacaaag ctctatcaaa acccaaccac ctatatttcc 661 gttgggacat caacactaaa ccagagattg gtacccagaa tagctactag atccaaagta 721 aacgggcaaa gtgggaggat agagttcttc tggacaattt taaaaccgaa tgatgcaatc 781 aacttcgaga gtaatggaaa tttcattgct ccagaatatg catacaaaat tgtcaagaga 841 ggggactcaa caattatgaa aagtgaattg gaatatggta actgcaacac caagtgtcaa 901 actccaatag gggcgataaa ctctagtatg ccattccaca atatacaccc tctcaccatc 961 ggggagtgcc ccaaatatgt gaaatcaacc agattagtcc ttgcgactgg gctcagaaat 1021 agccctcaaa gagagagaag aagaaaaaag agaggattat ttggagctat agcaggtttt 1081 atagaaggag gatggcaggg aatggtagat ggttggtatg ggtaccacca tagcaatgag 1141 caggggagtg ggtacgctgc agacaaagaa tccactcaaa aggcaataga tggagtcacc 1201 aataaggtca actcgatcat tgacaaaatg aacactcagt ttgaggccgt tggaagggaa 1261 tttaacaact tagaaaggag aatagagaat ttaaacaaga agatggaaga cgggttccta 1321 gatgtctgga cttataatgc tgaacttctg gttctcatgg aaaatgagag aactctagac 1381 tttcatgact caaatgtcaa gaacctttac gacaaggtcc gactacagct tagggataat 1441 gcaaaggagc tgggtaacgg ttgtttcgag ttctatcata aatgtgataa tgaatgtatg 1501 gaaagtgtaa gaaacggaac gtatgactac ccgcagtatt cagaagaagt aagattaaaa 1561 agagaggaaa taagtggagt aaaattggaa tcaataggaa tttaccaaat actgtcaatt 1621 tattctacag tggcgagttc cctagcactg gcaatcatgg tagctggtct atccttatgg 1681 atgtgctcca atgggtcgtt acaatgcaga atttgcattt aatgagcggc cgc //
ORGANISM synthetic construct
other sequences; artificial sequences. REFERENCE 1 (bases 1 to 1370)
AUTHORS Tran,Q.V., Nguyen,B.N., Le,T.B., Nong,V.H. and Le,T.H. TITLE Molecular characterization of H5N1 isolates in Vietnam for evolution/pathogenicity/antigenic compatibility using N1 sequences as markers
JOURNAL Unpublished
REFERENCE 2 (bases 1 to 1370)
AUTHORS Tran,Q.V., Nguyen,B.N., Le,T.B., Nong,V.H. and Le,T.H. TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (11-OCT-2006) Immunology Department, Institute of Biotechnology, Hoang Quoc Viet Rd, Hanoi 10000, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1370
/organism="synthetic construct" /mol_type="other RNA"
/db_xref="taxon:32630"
/PCR_primers="fwd_name: N1ECOF, fwd_seq:
ccggaattcaaaatgaatccaaatcagaagataataacc, rev_name: N1NOTR, rev_seq: ataagaatgcggccgctcactacttgtcaatggtgaatgg" /note="derived from Influenza A virus
(A/chicken/Vietnam/HG4/2005(H5N1)) isolate HG4 (Hau Giang)" primer_bind <1..36 gene 10..1359 /gene="NA" CDS 10..1359 /gene="NA" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="neuraminidase" /protein_id="ABK58128.1" /db_xref="GI:117938336" /translation="MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQVGNMISIWVSHSIHTGNQH QAEPISNTNFLNEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFI SCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWS ASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSC FTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELNAPNYHYEECSCYPDAGEITCVCRDNW HGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAYGVKGFSFKYG NGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHPEL TGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK" primer_bind complement(1339..>1370) ORIGIN
1 gaattcaaaa tgaatccaaa tcagaagata ataaccattg gatcaatctg tatggtaact 61 ggaatagtta gcttaatgtt acaagttggg aacatgatct caatatgggt cagtcattca 121 attcacacag ggaatcaaca ccaagctgaa ccaatcagca atactaattt tcttaatgag 181 aaagctgtgg cttcagtaaa attagcgggc aattcatctc tttgccccat taacggatgg 241 gctgtataca gtaaggacaa cagtataagg atcggttcca agggggatgt gtttgttata 301 agagagccgt tcatctcatg ctcccacttg gaatgcagaa ctttcttttt gactcaggga 361 gccttgctga atgacaaaca ctccaatggg actgtcaaag acagaagccc tcacagaaca 421 ttaatgagtt gtcctgtggg tgaggctccc tccccatata actcaaggtt tgagtctgtt 481 gcttggtcag caagtgcttg ccatgatggc accagttggt tgacaattgg aatttctggc 541 ccagacaatg gggctgtggc tgtattgaaa tacaatggca taataacaga cactatcaag 601 agttggagga acaacatact gagaactcaa gagtctgaat gtgcatgtgt aaatggctct 661 tgctttactg taatgactga cggaccaagt aatggtcagg catcacataa gatcttcaaa 721 atggaaaaag ggaaagtggt taaatcagtc gaattgaatg ctcctaatta tcactatgag 781 gaatgctcct gttatcctga tgccggcgaa atcacatgtg tgtgcaggga taattggcat 841 ggctcaaatc ggccatgggt atctttcaat caaaacttgg agtatcaaat aggatatata 901 tgcagtggag ttttcggaga caatccacgc cccaatgatg gaacaggtag ttgtggtccg 961 gtgtcctcta acggggcata tggggtaaaa gggttttcat ttaaatacgg caatggtgtc 1021 tggatcggga gaaccaaaag cactaattcc aggagcggct ttgaaatgat ttgggatcca 1081 aatgggtgga ctgaaacgga cagtagcttt tcagtgaaac aagacatcgt agcaataact 1141 gattggtcag gatatagcgg gagttttgtc cagcatccag aactgacagg actagattgc 1201 ataagacctt gtttctgggt tgagttgatc agagggcggc ccaaagagag caccatttgg 1261 actagtggga gcagcatatc tttttgtggt gtaaatagtg acactgtggg ttggtcttgg 1321 ccagacggtg ctgagttgcc attcaccatt gacaagtagt gagcggccgc
A. Gen PB2 3 0 6 0 9 0 1 2 0 A T G G A G A G A A T A A A A G A A T T A C G A G A T C T A A T G T C A C A G T C C C G C A C T C G C G A G A T A C T A A C A A A A A C C A C T G T G G A C C A T A T G G C C A T A A T C A A G A A A T A C A C A T C A G G A A G A C A A G A G M E R I K E L R D L M S Q S R T R E I L T K T T V D H M A I I K K Y T S G R Q E > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ > 1 5 0 1 8 0 2 1 0 2 4 0 A A G A A C C C T G C T C T C A G A A T G A A A T G G A T G A T G G C A A T G A A A T A T C C A A T C A C A G C G G A C A A G A G A A T A A T A G A G A T G A T T C C T G A A A G G A A T G A A C A A G G G C A G A C G C T C T G G A G C A A G K N P A L R M K W M M A M K Y P I T A D K R I I E M I P E R N E Q G Q T L W S K > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ > 2 7 0 3 0 0 3 3 0 3 6 0 A C A A A T G A T G C T G G A T C G G A C A G G G T G A T G G T G T C T C C C C T A G C T G T A A C T T G G T G G A A T A G G A A T G G G C C G G C A A C A A G T G C A G T T C A T T A T C C A A A G G T T T A C A A A A C A T A C T T T G A G T N D A G S D R V M V S P L A V T W W N R N G P A T S A V H Y P K V Y K T Y F E > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ > 3 9 0 4 2 0 4 5 0 4 8 0 A A G G C T G A A A G G T T A A A A C A T G G A A C C T T C G G T C C C G T C C A T T T C C G A A A C C A A G T T A A A A T A C G C C G C C G A G T G G A T A T A A A C C C T G G C C A T G C A G A T C T C A G T G C T A A A G A A G C A C A A K A E R L K H G T F G P V H F R N Q V K I R R R V D I N P G H A D L S A K E A Q > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ > 5 1 0 5 4 0 5 7 0 6 0 0 G A T G T C A T C A T G G A G G T C G T T T T C C C A A A T G A A G T G G G A G C T A G A A T A T T G A C A T C A G A G T C G C A A T T G A C A A T A A C G A A A G A G A A G A A A G A A G A G C T C A A A G A T T G T A A G A T T G C T C C C D V I M E V V F P N E V G A R I L T S E S Q L T I T K E K K E E L K D C K I A P > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ > 6 3 0 6 6 0 6 9 0 7 2 0 T T A A T G G T T G C A T A C A T G T T G G A A A G G G A A C T G G T C C G C A A A A C C A G A T T C C T A C C G G T A G C A G G C G G A A C A A G C A G T G T G T A C A T T G A G G T A T T G C A T T T G A C T C A A G G G A C C T G C T G G L M V A Y M L E R E L V R K T R F L P V A G G T S S V Y I E V L H L T Q G T C W > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ > 7 5 0 7 8 0 8 1 0 8 4 0 G A A C A G A T G T A C A C T C C A G G C G G A G A A G T G A G A A A T G A C G A T G T T G A C C A G A G T T T G A T C A T C G C T G C C A G A A A C A T T G T T A G G A G A G C A A C G G T A T C A G C G G A T C C A C T G G C A T C A C T G E Q M Y T P G G E V R N D D V D Q S L I I A A R N I V R R A T V S A D P L A S L > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ > 8 7 0 9 0 0 9 3 0 9 6 0 C T G G A G A T G T G T C A C A G C A C A C A A A T T G G T G G G A T A A G G A T G G T G G A C A T C C T T A G G C A A A A T C C A A C T G A G G A A C A A G C T G T G G A T A T A T G C A A A G C A G C A A T G G G T C T G A G G A T C A G T L E M C H S T Q I G G I R M V D I L R Q N P T E E Q A V D I C K A A M G L R I S > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ > 9 9 0 1 0 2 0 1 0 5 0 1 0 8 0 T C T T C C T T T A G C T T T G G A G G C T T C A C T T T C A A A A G A A C A A G T G G A T C A T C C G T C A A G A A G G A A G A G G A A G T G C T T A C A G G C A A C C T C C A A A C A T T G A A A A T A A G A G T A C A T G A G G G G T A T S S F S F G G F T F K R T S G S S V K K E E E V L T G N L Q T L K I R V H E G Y > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ > 1 1 1 0 1 1 4 0 1 1 7 0 1 2 0 0 G A G G A A T T C A C A A T G G T T G G G C G G A G G G C A A C A G C T A T C C T G A G G A A A G C A A C T A G A A G G C T G A T T C A G T T G A T A G T A A G T G G A A G A G A C G A A C A A T C A A T C G C T G A G G C A A T C A T T G T A E E F T M V G R R A T A I L R K A T R R L I Q L I V S G R D E Q S I A E A I I V > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ > 1 2 3 0 1 2 6 0 1 2 9 0 1 3 2 0 G C A A T G G T G T T C T C A C A G G A G G A T T G C A T G A T A A A G G C A G T C C G A G G C G A T C T G A A T T T C G T A A A C A G A G C A A A C C A A A G A T T A A A C A C C A T G C A T C A A C T C C T G A G A C A T T T T C A A A A G A M V F S Q E D C M I K A V R G D L N F V N R A N Q R L N T M H Q L L R H F Q K > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ > 1 3 5 0 1 3 8 0 1 4 1 0 1 4 4 0 G A T G C A A A A G T G T T A T T T C A G A A T T G G G G A A T T G A A C C C A T T G A T A A T G T C A T G G G G A T G A T C G G A A T A T T A C C T G A C A T G A C T C C C A G C A C A G A A A T G T C A C T G A G A G G A G T A A G A G T T D A K V L F Q N W G I E P I D N V M G M I G I L P D M T P S T E M S L R G V R V > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ > 1 4 7 0 1 5 0 0 1 5 3 0 1 5 6 0 A G T A A A A T G G G A G T G G A T G A A T A T T C C A G C A C T G A G A G A G T A G T T G T A A G C A T T G A C C G T T T C T T A A G G G T T C G A G A T C A G C G G G G G A A C G T A C T C T T A T C T C C C G A A G A G G T C A G C G A A S K M G V D E Y S S T E R V V V S I D R F L R V R D Q R G N V L L S P E E V S E > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ > 1 5 9 0 1 6 2 0 1 6 5 0 1 6 8 0 A C C C A G G G A A C A G A G A A A T T G A C A A T A A C A T A T T C A T C A T C A A T G A T G T G G G A A A T C A A C G G T C C T G A G T C A G T G C T T G T T A A C A C C T A T C A G T G G A T C A T C A G A A A C T G G G A G A C T G T G T Q G T E K L T I T Y S S S M M W E I N G P E S V L V N T Y Q W I I R N W E T V > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ > 1 7 1 0 1 7 4 0 1 7 7 0 1 8 0 0 A A G A T T C A A T G G T C T C A A G A C C C C A C G A T G C T G T A C A A T A A G A T G G A G T T T G A A C C G T T C C A A T C C T T G G T A C C C A A A G C T G C C A G A G G T C A A T A C A G T G G A T T T G T G A G A A C A T T A T T C K I Q W S Q D P T M L Y N K M E F E P F Q S L V P K A A R G Q Y S G F V R T L F > _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T R A N S L A T I O N O F C K H G 4 - P B 2 ( 2 2 8 0 B P ) F . T X T [ A ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ >