nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam
Sự tiến hoá của virus cúm gia cầm H5N1 có thể làm thay đổi tính kháng nguyên, hình thành các nhánh virus khác nhau,ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm phòng vaccine. Từ năm 2001 đến 2007 đã có 6 clade virus cúm gia cầm H5N1 lưu hành tại Việt Nam, bao gồm: clade 0, clade 1, clade 2.3.2, clade 2.3.4, clade 3, clade 5 (Wan và cs, 2008) [152]. Đầu năm 2008, chủng virus cúm A/H5N1 thuộc clade 7 đãđược phát hiện trên gà nhập lậu qua đường Lạng Sơn
(Nguyen và cs, 2009) [117]. Năm 2011,Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) và Tổ
chức Y tế thế giới (WHO) thông báo đã phát hiện các phân nhánh virus cúm
A/H5N1 thể độc lực cao thuộc clade 1.1 và 2.3.2.1 tại Việt Nam (FAOAIDEnews, 2011) [168], (WHO, 2011) [170], (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012) [20]. Các phân nhánh này không phải mới xuất hiện mà được hình thành trong quá trình tiến hoá tự nhiên. Phân nhánh 1.1 có nguồn gốc từ clade 1. Phân nhánh 2.3.2.1
được tiến hóa từ clade 2.3.2(WHO, 2011) [170].
Kết quả nghiên cứu của Long và cộng sự (2011) [103] trên 15 mẫu gia cầm mắc bệnh thu nhận từ các tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng, Khánh Hòa và Bến Tre trong giai đoạn từ tháng 1 đến tháng 3 năm 2010 cho thấy, gen HA của các chủng virus cúm A/H5N1 đã tạo nên một phân nhánh mới so với các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc clade 1. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm gia cầm A/H5N1 thuộc clade 1 tại Việt Nam và Campuchia cho thấy đã có sự hình thành clade 1.1. Từ cuối năm 2010, clade 1.1 được phát hiện ở gia cầm tại các tỉnh phía Nam của Việt Nam, ở gia cầm và người tại Campuchia (WHO, 2011) [170].
Tại các tỉnh phía Nam clade 1 lưu hành suốt từ năm 2003 đến nay; trong khi ở các tỉnh phía Bắc, duyên hải miền Trung và Tây Nguyên luôn có sự thay thế của các clade virus cúm A/H5N1 mới, cụ thể năm 2007 clade 2.3.4 thay thế clade 1, năm 2010 clade 2.3.2 thay thế clade 2.3.4 và tiếp tục lưu hành cho đến nay (Văn
Đăng Kỳ, 2012) [15].
Hiện nay, clade 2.3.2 đã biến đổi và phát triển thành 2 clade phụ (clade 2.3.2.1a và clade 2.3.2.1b) có sự khác biệt lớn về kháng nguyên. Clade phụ 2.3.2.1a lưu hành rộng rãiở hầu khắp các tỉnh Bắc Giang, Bắc Kạn, Bắc Ninh, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa, Hải Phòng, Bình Định, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Quảng Ngãi, Khánh Hòa,Đắk Lắk, Lâm Đồng, Tây Ninh; trong khi đó clade phụ 2.3.2.1b chỉ phát hiện tại Nam Định, Thái Bình, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Kạn và Nghệ An (Văn Đăng Kỳ, 2012) [15].
. Thí nghiệm của Cục Thú y đánh giá độc lực của virus clade 2.3.2 cho thấy, sau khi công cường độc 100% gà bị chết trong vòn g 3 ngày và 20% vịt chết trong vòng 7 ngày. Như vậy, clade virus mới này rất độc đối với gà và ít độc hơn với vịt (clade 1 và clade 2.3.4 có thể gây chết 60-70% vịt) (Văn Đăng Kỳ, 2012) [15].
Vaccine H5N1 Re-1 vẫn có hiệu quả đối với virus clade 1 và clade 2.3.4, đối với clade 2.3.2.1a hiệu quả bảo hộ chỉ đạt khoảng 80% nếu tiêm 1 mũi, còn đối với clade 2.3.2.1b kể cả khi tiêm 2 mũi thì tỷ lệ bảo hộ chỉ đạt 50%. Vaccine H5N1 Re- 5 nếu tiêm 1 mũi thì tỷ lệ bảo hộ đạt 70% với clade 2.3.2.1a và không bảo hộ với clade 2.3.2.1b.
Hiện nay, tại Việt Nam chưa phát hiện virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 ở người. Tuy nhiên, do chưa có vaccine tiêm phòng cho gia cầm đối với clade 2.3.2.1 nên gia cầm hoàn toàn không được bảo hộ miễn dịch tạo điều kiện cho virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 có thể tiếp tục biến đổi trở thành nguy cơ gây bệnh trên người (WHO, 2011) [170], (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012) [20]. Do đó, giám sát virus cúm ở gia cầm, áp dụng các biện pháp phòng chống dịch thích hợp là việc làm cần thiết nhằm ngăn chặn sự truyền lây dịch ở gia cầm và từ
gia cầm sang người.
1.4 PHẢN ỨNG RT-PCR TRONG NGHIÊN CỨU VIRUS CÚM A
Hệ gen của virus cúm A là một tập hợp các chuỗi nucleotide phân bố trong các phân đoạn dài ngắn khác nhau. Phương pháp sinh học phân tử sử dụng phản ứng RT-PCR và real-time PCR trong chẩn đoán, giám định, phân loại, giải trình trình tự các phân đoạn và toàn bộ hệ gen, di truyền quần thể, xem xét tiến hóa và nguồn gốc các biến chủng được cho là phương pháp tối ưu trong nghiên cứu virus cúm A gây bệnh ở động vật và người (Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7].RT-PCR có thể sử dụng nhân các gen ”độc” HA và NA, cũng như các gen khung (backbone genes) của virus cúm A để giải trình tự, đối chiếu so sánh thành phần nucleotide của các subtype H và N; phân biệt chủng độc lực cao (HPAI) và chủng độc lực thấp (LPAI) qua phân tích chuỗi nối giữa HA1 và HA2; tìm nguồn gốc tiến hóa của gen HA và biến thể gen của virus cúm A/H5N1 (Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7].
Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuôn RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR, bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn thứ nhất là chuyển đổi RNA một sợi làm khuôn thành DNA (2 sợi) gọi là chuyển đổi cDNA và giai đoạn thứ hai là dùng DNA hai sợi này tiếp tục làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR.
RNA có cấu trúc một sợi bao gồm các nucleotide liên kết với nhau, trong đó có Adenine (A), Guanine (G), Cytosine (C), nhưng Thymine (T) (trong cấu trúc DNA) được thay thế bằng Uracil (U). Chuỗi nucleotide này phải được chuyển đổi thành DNA hai sợi, trong đó thành phần Uracil được thay thế bằng Thymine. Phản ứng này làm biến đổi RNA hệ gen thành DNA phải nhờ đến vai trò của enzym sao chép ngược (Reverse - Transcriptase enzyme), do vậy giai đoạn này được gọi là giai đoạn chuyển ngược, được thực hiện ở 42-45oC hoặc 50-550C. Khi đã có DNA hai sợi làm khuôn chuyển đổi từ RNA ban đầu, phản ứng tiếp theo sẽ là PCR. Toàn bộ phản ứng nhân một đoạn DNA từ khuôn RNA qua hai giai đoạn nói trên, được gọi là phản ứng RT-PCR hay phản ứng PCR ngược.
RT-PCR một bước hoặc RT-PCR hai bước. Trong chẩn đoán và xác định virus cúm A hiện nay phương pháp RT-PCR một bước (one-step RT-PCR) được đánh giá là phương pháp có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh và phù hợp với các kết quả phân lập virus RNA gây bệnh.
1.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS CÚM A/H5N1 TẠI VIỆT NAM
Bệnh cúm gia cầm xuất hiện tại Việt Nam từ cuối năm 2003 (Trương Văn
Dung và Nguyễn Viết Không, 2004) [3]. Từ đó đến nay đã có nhiều nghiên cứu về virus và bệnh cúm gia cầm H5N1 ở Việt Nam, chủ yếu tập trung nghiên cứu về dịch tễ bệnh, khảo sát sự lưu hành của virus, các phương pháp chẩn đoán, nghiên cứu ứng dụng vaccine, xác định hàm lượng kháng thể sau tiêm phòng, điều tra mức độ nhiễm bệnh và hướng phòng chống, giám định phân tử và phân nhóm phả hệ virus gây bệnh; và nghiên cứu sản xuất, thử nghiệm vaccine.
Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử (định týp, biến đổi di truyền và gen học tiến hoá) của virus gây bệnh cúm gia cầm H5N1 được các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003 (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]. Các chuỗi gen giúp xác định phân týp H5, phân týp N1 và các gen cấu trúc đãđược Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen (Le Thanh Hoa và cs, 2006) [95], (Nguyen và cs, 2008) [116], (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012) [20]. Trên cơ sở phân tích trình tự gen kháng nguyên H5 và N1, các tác giả khẳng định nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam cùng nhóm với virus H5N1 phân lập tại Trung Quốc (Nguyễn Tiến
Dũng và cs, 2004) [4], (Le Thanh Hoa và cs, 2006) [95], (Muramoto và cs, 2006)
[112], (Wan và cs, 2008) [152]. Các biến chủng H5N1 của Hồng Kông, Trung Quốc phân lập những năm 1997-2001 và Hàn Quốc, Đài Loan phân lập năm 2003 đều có nguồn gốc từ chim cút và ngỗng (A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng Đông, đó là các biến chủng thuộc dòng Quảng Đông (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004) [4] ,
(Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]. Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh ở gia cầm và người tại Việt Nam là cúm H5N1 týp A thuộc thế hệ mới đã có biến đổi về gen H5 và gen N1, nhưng vẫn cùng nguồn gốc với H5N1 từ vùng địa lý Nam Trung Quốc và Hồng Kông (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004) [4], (Nguyen và cs, 2008) [116], (Li và cs, 2004) [97], (Smith và cs, 2006) [137]. Sự xâm nhập và tiến hóa của các biến chủng virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam cũng đãđược nhiều tác giả nghiên cứu (Nguyen và cs, 2008) [116], (Wan và cs, 2008) [152], (Nguyen và cs, 2009) [117], (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012) [20]. Tại Việt Nam, ngoài sự lưu hành của các chủng phân dòng Quảng Đông, năm 2007 xuất hiện thêm biến chủng H5N1 phân dòng Phúc Kiến (clade 2.3.4) (Nguyễn Mạnh Kiên và cs, 2008) [13], (Nguyen và cs, 2008) [116], (Wan và cs, 2008) [152], (Le và cs, 2008) [93]và đến nay xuất hiện clade 2.3.2.1 (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012) [20], (Văn Đăng Kỳ, 2012) [15] đã vàđang làm phức tạp thêm vấn đề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên - miễn dịch.
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương, Viện Thú y trung ương đã tiến hành thu thập gen kháng nguyên H5 và N1 từ các chủng phân lập trên gà, vịt, ngan của Việt Nam, so sánh với trình tự chuỗi gen cúm A/H5N1 của các chủng cường độc đương nhiễm và vaccine của Việt Nam và thế giới để nghiên cứu về gen học kháng nguyên liên quan đến vaccine và miễn dịch (Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7], (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004) [4], (Le Thanh Hoa và cs, 2006) [95], (Lê Trần Bình, 2007) [1], (Nguyen và cs, 2008) [116], (Le và cs, 2008) [93], (Nguyễn Thị Bích Nga và cs, 2011) [19], (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012) [20]. Phân tích các chuỗi gen thu nhận từ nhiều vùng miền khác nhau trong cả nước, nhiều nghiên cứu khẳng định đã có sự hỗn hợp virus gây bệnh và phân hoá kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam (Nguyen và cs, 2008) [116], (Le và cs, 2008) [93], (Wan và cs, 2008) [152], (Nguyễn Tùng và cs, 2011) [30], (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012) [20],(Văn Đăng Kỳ, 2012) [15].
dựng các phương pháp chẩn đoán, phát hiện nhanh virus gây bệnh, phân biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các phân týp HA và NA. Các phương pháp phát hiện nhanh virus cúm A/H5N1 và các phân týp khác bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử cũng đã được xây dựng (Chan và cs, 2007) [43], (Wu và cs, 2008b) [161]. Nhiều nghiên cứu khảo sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm H5N1 (Dương Thị Thanh Thảo và Lý Thị Liên Khai, 2011) [27], (Lưu Hữu Mãnh và cs, 2011) [17], (Văn Đăng Kỳ, 2012)
[15]) và đánh giá đáp ứng miễn dịch của gia cầm sau tiêm phòng vaccine tại các địa phương khác nhau của Việt Nam (Tô Long Thành và Đào Yến Khanh, 2009) [26], (Nguyễn Hoàng Đăng và Tô Long Thành, 2009) [6], (Trịnh Thị Quý và cs, 2010 ) [23], (Lê Đình Nghi và cs, 2010) [21], (Nguyễn Văn Cảm và cs, 2011) [2] cũng đã được tiến hành. Các nhà khoa học Việt Nam đã có những đóng góp nhất định trong lĩnh vực nghiên cứu vaccine và miễn dịch. Những chế phẩm kháng nguyên, vaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam cũng đãđược tạo ra (Gao và cs, 2006) [66], (Lu và cs, 2006) [104], (Lê Trần Bình, 2007) [1].
Trong lĩnh vực sản xuất vaccine, các đề tài cấp nhà nước của Viện Công nghệ Sinh học “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho
gia cầm”, và “Đánh giá chất lượng vaccine phòng bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tại Việt Nam bằng chủng NIBRG-14” đãđược thực hiện (Lê Trần Bình, 2007) [1].
Kết quả là đã sản xuất được vaccine từ chủng NIBRG-14; xây dựng được các qui trình sản xuất giống, sản xuất vaccine, kiểm nghiệm và bảo quản vaccine cúm A/H5N1 và miễn dịch của vaccine đạt chất lượng khi kiểm nghiệm bằng phương pháp huyết thanh học và công cường độc (Nguyễn Thị Lan Phương và Lê Văn
Hiệp, 2006) [22], (Lê Trần Bình, 2007) [1]. Ngoài ra, một số đề tài nhà nước khác
nghiên cứu dịch tễ học phân tử, chẩn đoán, vector tái tổ hợp dẫn truyền gen kháng nguyên sử dụng adenovirus hoặc LaSoTa virus, chuyển gen vào thực vật cũng được tiến hành (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]. Một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật/công nghệ cao (di truyền ngược, tái tổ hợp vector) sử dụng nguồn gen H5N1
của Việt Nam, công nghệ tái tổ hợp sản xuất chế phẩm kháng nguyên H5 trong thực vật và tế bào, cũng đang được tiến hành tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Thú y, Viện Di truyền Nông nghiệp và một số c ơ sở nghiên cứu khác (Lê Thanh Hòa, 2006) [10], (Lê Trần Bình, 2007) [1], (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]. Ngoài những nghiên cứu về cúm A/H5N1 ở gia cầm, các cơ sở y tế như bệnh viện, viện nghiên cứu (Bệnh viện Nhi trung ương, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ư ơng, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, Viện vaccine Nha Trang) đều có triển khai các lĩnh vực nghiên cứu liên quan đến cúm A/H5N1 trên người (Le và cs, 2005) [92], (Nguyễn Thị Kim Tiến, 2005) [28], (Cao Thị Bảo Vân và cs, 2005) [32], (Dinh và cs, 2006) [56], (Chan và cs, 2007) [43], (Hatta và cs, 2007) [74], (Lê Quỳnh Mai,
2011) [16].
Những kết quả nghiên cứu về cúm A/H5N1 ở gia cầm và người trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam đã và đang làm sáng tỏ thêm về mối quan hệ tiến triển bệnh học lây nhiễm, dịch tễ học phân tử, phát triển tiến hoá và genotype, và kháng nguyên-miễn dịch-vaccine của cúm gia cầm tại Việt Nam (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]. Tuy nhiên, trong những năm đầu tiên khi dịch cúm gia cầm mới bùng phát, do tập trung đối phó với dịch nên phần lớn các công trình nghiên cứu về virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam còn thiếu sự gắn kết giữa nghiên cứu về gen với nghiên cứu dịch tễ học; những năm sau đó, các nghiên cứu dần dần có tính hệ thống hơn. Các công trình nghiên cứu chủ yếu là về virus cúm A/H5N1, tập trung trong lĩnh vực dịch tễ học và khả năng kháng thuốc của virus, chưa quan tâm nhiều đến các phân týp virus cúm A khác nên rất khó dự đoán khả năng trao đổi chéo, tái tổ hợp gen giữa các phân týp virus cúm A. Số lượng các công trình nghiên cứu về sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 đảm bảo được tính hệ thống, liên tục từ nghiên cứu hệ gen đến biểu hiện protein, tạo kháng nguyên làm nguyên liệu sản xuất vaccine còn rất hạn chế. Những nghiên cứu về khả năng tạo miễn dịch của các loại vaccine sử dụng đãđược thực hiện tại một số địa phương. Tuy nhiên, do số liệu khảo sát về đáp ứng miễn dịch của gia cầm trên toàn quốc và những nghiên cứu về tương quan kháng nguyên - miễn dịch của các chủng virus cúm A/H5N1 hiện hành còn chưa
đầy đủ, mặt khác, do sự đa dạng kháng nguyên của các chủng virus cúm A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam nên việc nghiên cứu sản xuất vaccine còn hạn chế. Gần đây, Viện Công nghệ Sinh học trên cơ sở đề tài cấp nhà nước đã hoàn thiện quy trình sản xuất vaccine NIBRG-14 (clade 1) và đã chuyển giao cho công ty thuốc thú y trung ương II (NAVETCO). Hiện nay, NAVETCO đã được cấp phép sản xuất loại vaccine này. Tuy nhiên, do sự xuất hiện của clade 2.3.2.1a và 2.3.2.1b nên việc nghiên cứu và cập nhật các loại vaccine mới cần được tiếp tục.
1.6 TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC GIẢI MÃ HỆ GEN VIRUS CÚM A/H5N1
Một trong những đặc điểm quan trọng của virus cúm A/H5N1 là hệ gen luôn biến đổi để thích ứng gây bệnh. Do đó việc giải mã hệ gen, theo dõi thông tin di truyền của virus là hết sức cần thiết. Kết quả giải mã hệ gen là nguồn dữ liệu cung cấp thông tin về nguồn gốc xuất xứ, sự tiến hóa của virus, giúp phát hiện những biến chủng mới trong quần thể virus cúm gia cầm.
Trình tự nucleotide của 8 phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 phân lập từ gia cầm là cơ sở để xác lập mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa của các chủng virus cúm gia cầm lưu hành ở Việt Nam và thế giới theo thời gian. Trình tự nucleotide của các chủng virus phân lập ở các vùng miền khác nhau còn có vai trò quan trọng trong việc xác định các chủng virus đó là đồng chủng hay dị chủng giữa các địa phương, các vùng địa lý và các quốc gia khác nhau, từ đó có thể biết được dịch tễ học của bệnh cúm gia cầm ở mức độ sinh học phân tử.
Đột biến trong các gen kháng nguyên (HA và NA) và trong các gen khung khác (PB2, PB1, PB1-F2, NP, M và NS) của virus cúm A/H5N1 có thể làm thay đổi