Virus cúm A/H5N1 được phân lập lần đầu tiên ở gà bệnh tại Scotland năm 1959 (A/Ck/Scotland/1959(H5N1)), và các công trình nghiên cứu hệ gen cho thấy chủng A/H5N1 có nguồn gốc từ A/H6N2 trao đổi gen với A/H9N2 trên lợn, thuộc nhóm HPAI(Murphy và Webster, 1996) [113].
Virus cúm A/H5N1 gây dịch cúm gia cầm có nguồn gốc từ châu Á được đặt tên đầy đủ là “virus H5N1 dòng châu Á” (Nguyễn Tiến Dũng, 2008) [5],được phân lập từ ngỗng tại một ổ dịch ở Quảng Đông (Trung Quốc) năm 1996 và chủng này (A/Gs/GD/1/96) được coi là chủng nguyên thủy tạo nên các dòng virus gây bệnh cúm gia cầm trong những năm qua (Xu và cs, 1999) [162]. Chủng virus nguyên thuỷ A/Gs/GD/1/96 cung cấp nguồn gen HA(H5) cho tiến trình tái tổ hợp tạo nên các biến chủng gây dịch bệnh trên gia cầm và người ở Hồng Kông năm 1997, còn nguồn gen khung khác của virus cúm A/H5N1 Hồng Kông được thu nhận từ virus cúm A cóở chim cút (Guan và cs, 1999) [70]. Riêng nguồn gen NA (N1) còn chưa biết được lấy từ đâu, nhưng cấu trúc của gen có hiện tượng xoá đi 57 nucleotide mã hoá cho 19 amino acid, tại vùng đầu N của protein NA, và đ ột biến “xoá gen” này của N1 có liên quan đến tính thích ứng của virus cúm từ thuỷ cầm lên gia cầm trên cạn và người (Matrosovich và cs, 1999) [108]. Đối với gen HA (H5) đột biến giãn nở chuỗi nối giữa HA1 và HA2 mã hoá cho các amino acid kiềm (arginin và lysin) có liên quan đến tiến trình tăng cường độc lực, và ở các chủng thuộc phân dòng Quảng Đông (Guangdong-like sublineage), các amino acid thông thường là - RRRKK- (Matrosovich và cs, 1999) [108]. Sau một năm gây bệnh tại Hồng Kông, do toàn bộ đàn gia cầm bị tiêu diệt, virus cúm A/H5N1 nguyên thuỷ gốc Quảng Đông không còn gia cầm cạn để gây bệnh, người ta tưởng chúng đã biến mất, nhưng thực tế chủng nguyên thuỷ này vẫn tiếp tục tồn tại trong ngỗng ở vùng Nam Trung Quốc, trở thành nguồn gen tái tổ hợp hình thành biến chủng mới (Webster và cs, 2002) [157]. Tuy nhiên các chủng virus cúm A/H5N1 hiện nay chỉ mang phân đoạn HA của dòng virus gốc Quảng Đông nói trên (Duan và cs, 2007) [58], còn bảy
phân đoạn khác thu nhận từ các chủng virus cúm gia cầm khác thông qua sự tái tổ hợp di truyền(Zhao và cs, 2008) [164].
Do biến đổi di truyền liên tục nên protein HA của virus cúm A/H5N1 dòng châu Á có tính kháng nguyên thay đổi. Khi hiệu giá kháng thể HI giữa các chủng virus A/H5N1 dòng châu Á lệch nhau 2log trở lên thì chúng sẽ thuộc các nhóm kháng nguyên khác nhau. Gen HA của dòng A/Gs/GD/1/96 đã tiến hoá nhiều năm qua, tạo nên nhiều nhánh (clade) hay còn gọi là nhóm kháng nguyên, hiện đã có 9 nhóm kháng nguyên được ký hiệu từ 0-9 (WHO, 2008) [159], (Nguyễn Tiến Dũng,
2008) [5]. Riêng nhóm 2 được chia thành 5 nhóm phụ, đánh số từ 2.1 đến 2.5
(Nguyễn Tiến Dũng, 2008) [5].
Trong các năm 1997-2002, nhiều biến chủng virus cúm A/H5N1 mang nhiều đặc tính kháng nguyên khác nhau của phân týp H5 được hình thành tạo nên nhóm kháng nguyên (clade) 1 có độc lực cao với gà nhưng thấp đối với vịt, để rồi bị đào thải trong những năm 2001-2002 (Guan và cs, 2002) [71], (Li và cs, 2004) [97].
Tiếp tục, trong năm 2002-2003, phân đoạn HA (H5) có những đột biến mới do hậu quả của hiện tượng lệch kháng nguyên (antigenic drift), để rồi tạo nên biến chủng có tính gây bệnh rất cao, đặc biệt đối với vịt, và lây sang người (Guan và cs, 2004) [72]. Đặc tính thích ứng gây bệnh trên người ngày càng cao dần, cùng với độc lực tăng cường đối với nhiều vật chủ bao gồm gà, vịt, ngan, ngỗng, chim cút, chim hoang dã và người, để hình thành nhiều biến chủng xâm nhập các nước phía Nam châu Á trong đó có Việt Nam và Thái Lan (Guan và cs, 2004) [72], (Peiris và cs,
2004) [121].
Có thể nói, sau giai đoạn 1997-2003, virus cúm A/H5N1 đãđạt đến mức độ hoàn thiện về đặc tính gây bệnh và thíchứng đa vật chủ, trở nên mối nguy cơ gây bệnh rất cao đối với gia cầm và người trong các năm 2004-2005 (Li và cs, 2004) [97], (Smith và cs, 2006) [137]. Tuy nhiên, xét về di truyền học và tính kháng nguyên, các chủng H5N1 giai đoạn 1997-2002 vẫn mang tính đồng nhất kháng nguyên cùng với chủng nguyên thuỷ A/Gs/GD/1/96 của Quảng Đông (Chen và cs, 2004) [44], và bắt đầu phân hoá ở giai đoạn dịch cúm ác liệt xảy ra năm 2003-2005
(de Jong và Hien, 2006) [54]. Sự xuất hiện của genotype Z với tính gây bệnh ác liệt trong giai đoạn nàyở các nước Đông Nam Á là bằng chứng của sự đột biến “lệch
kháng nguyên” của cúm A/H5N1 (Li và cs, 2004) [97], (Wu và cs, 2008b) [161].
Cuối năm 2005, có nhiều phân dòng của virus cúm A/H5N1 cùng lúc được hình thành, đó là sự xuất hiện phân dòng Thanh Hải (Qinghai and Qinghai-like sublineage, clade 2.2) (Salzberg và cs, 2007) [129], (Nguyễn Tiến Dũng, 2008) [5]
và phân dòng Phúc Kiến (Fujian and Fujian-like sublineage, clade 2.3.4), tràn ngập châu Á bao gồm Trung Quốc, Hồng Kông, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia (Li và cs, 2004) [97], (Smith và cs, 2006) [137], tràn sang Trung Á, châu Âu và châu Phi có tính gây bệnh cao đối với người (Skeik và Jabr, 2007) [136], (Peiris và cs, 2007) [122], (Zhao và cs, 2008) [164].
Các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến có cấu trúc gen NA (N1) không thay đổi nhiều, nhưng gen HA (H5) có motif amino acid ở vùng nối của điểm cắt protease là -RRRK-, giảm mất một lysin (K) so với các chủng phân dòng Quảng Đông (Smith và cs, 2006) [137], và do vậy kể từ 2006 đến 2008, nhiều chủng/dòng virus cúm A/H5N1 cùng tồn tại gây bệnh, trong đó có các chủng ở Việt Nam
(Nguyen và cs, 2008) [116]. Trong các năm 2006-2008, tuy bình diện dịch cúm gia cầm không ác liệt như những năm 2003-2005, nhưng do xuất hiện nhiều chủng virus cúm A/H5N1 có biến động kháng nguyên và độc lực, vấn đề dịch tễ học cúm A/H5N1 có thể đã trở nên phức tạp hơn (Zhao và cs, 2008) [164], (Gambotto và cs, 2008) [65].
1.3.2 Sự xâm nhập các genotype của virus cúm A/H5N1 vào Việt Nam
Kể từ khi cúm A/H5N1 hiện đại xuất hiện tại Quảng Đông (A/Gs/GD/1/96(H5N1)(Xu và cs, 1999) [162], có tất cả 12 genotype, bao gồm GD, A, B, C, D, E, X (X0-X3), V, Y, W, Z (Z+) và G đã được phát hiện, trong đó các chủng H5N1 của Việt Nam là loại mới biến đổi, hầu hết thuộc genotype Z, G và V
(Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004) [4], (Nguyen và cs, 2008) [116]. Từ năm 2002 trở lại đây, những genotype nguyên thủy của dòng Quảng Đông đã không còn tồn tại (đó là các genotype A, C, D, E), nhưng lại tiến hoá xuất hiện 8 genotype của H5N1
(V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+)(Li và cs, 2004) [97], (Macken và cs, 2006) [105]. Dựa vào gen HA, sáu clade khác nhau đã được Tổ chức Y tế thế giới xác định và sắp xếp theo hệ thống danh pháp dành cho virus H5N1 thể độc lực cao, bao gồm: clade 0, HK97-like (HK/483/97); clade 1 (HK821-like, Dk/HK821/02); clade 2.3.2 (E319-like, Dk/China/E319-2/03); clade 2.3.4 (Fj584-like, Ck/Fujian/584/05); clade 3 (GX22-like, Dk/GX/22/01); clade 5 (F1-like, swine/Fujian/F1/01) (WHO, 2008) [159]. Sáu clade HA này cùng nhóm với các virus tiền thân đãđược phân lập trước đó ở Trung Quốc và Hồng Kông. Các virus tiền thân này có thể là thủy tổ của các dòng virusở Việt Nam(Wan và cs, 2008) [152] (Hình 1.11).
Nghiên cứu của Wan và cộng sự (2008) [152] cho thấy, virus cúm gia cầm A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2001-2007 bao gồm 9 genotype (từ VN1 đến VN9) tương ứng với 6 kiểu hình kháng nguyên ( clade 0, clade 1, clade 2.3.2, clade 2.3.4, clade 3, clade 5). Genotype VN1 xuất hiện năm 2001 (thuộc clade 3), VN2: năm 2003 (clade 5), VN3: các năm 2003-2007 (clade 1), VN4: từ năm 2005 (clade 2.3.2), VN5: năm 2005 (clade 0), VN6: từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN7: từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN8: từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN9: từ năm 2007 (clade 2.3.4).
Hình 1.11: Sự xâm nhập của virus cúm A/H5N1 độc lực cao vào Việt Nam
Chủng virus A/H5N1 thuộc clade 2.3.4 xâm nhập vào miền Bắc Việt Nam năm 2007, tái tổ hợp với các chủng virus thuộc clade 1 tồn tại trước đó, dẫn đến xuất hiện các genotype mới với nguồn gen NA và/hoặc nguồn gen khung lấy từ chủng virus thuộc clade 1 (Wan và cs, 2008) [152], (Nguyen và cs, 2008) [116]. Đầu năm 2008 chủng virus cúm A/H5N1 thuộc clade 7 được phát hiện trên gà nhập lậu tại cửa khẩu Lạng Sơn (Nguyen và cs, 2009) [117]. Năm 2011 FAO và WHO xác nhận virus cúm A/H5N1 thuộc 2 clade 2.3.2.1 và 1.1 cũng đã xuất hiện tại Việt Nam(FAOAIDEnews, 2011) [168], (WHO, 2011) [170].
Phân tích động thái lây nhiễm virus H5N1 cho thấy đa số các chủng virus có chứa các gen mới đều được phát hiện đầu tiên ở miền Bắc Việt Nam, tiếp đó lan truyền tới miền Nam sau khi đã tái tổ hợp với các chủng virus tồn tại trước đó ở miền Bắc (Wan và cs, 2008) [152].
Các chủng H5N1 phân lập tại Việt Nam trong những năm 2004-2006, thuộc phân dòng Quảng Đông, tập trung chủ yếu là genotype Z (Smith và cs, 2006) [137], (Nguyen và cs, 2008) [116]. Genotype Z được xác định lần đầu tiên tại Trung Quốc năm 2002(Wan và cs, 2008) [152]. Mặc dù đường xâm nhập của virus genotype này vào Việt Nam còn chưa xác định, các chủng virus phân lập tại Việt Nam có quan hệ phả hệ gần gũi với các phân lập virus của Trung Quốc, chứng tỏ có sự lan truyền trực tiếp virus H5N1 giữa Việt Nam và Trung Quốc(Wang và cs, 2008) [154]. Virus genotype Z lưu hành cả ở miền Bắc và miền Nam Việt Nam từ khi chúng xâm nhập, xen lẫn với những genotype phát hiện trước đó vào đầu năm 2003, tiếp tục tồn tại ít nhất là đến đầu năm 2007 (Wan và cs, 2008) [152], và được phân thành 2 nhóm: nhóm N (North) phổ biến ở Bắc Việt Nam và nhóm S (South) phân bố ở miền Nam; gần đây xuất hiện thêm genotype G (Smith và cs, 2006) [137], (Nguyen và cs, 2008)
[116]. Sự xuất hiện của genotype G có thể do quá trình tái tổ hợp của genotype W và genotype Z (Chen và cs, 2006) [46]. Năm 2007, ngoài các chủng và genotype thuộc phân dòng Quảng Đông gây dịch cúm gia cầm, còn có một phân dòng khácđã được phân lập và xác định bằng sinh học phân tử phân tích gen H5 và N1, đó là phân dòng Phúc Kiến (Nguyen và cs, 2008) [116]. Tiến hoá chủng/týp và dòng tái tổ
hợp mới thường định hình và xuất phát từ các tỉnh ở Nam Trung Quốc (Smith và cs, 2006) [137], (Wang và cs, 2008) [154].
Mặc dù đường xâm nhập và lan truyền H5N1 ở Việt Nam còn mang tính suy đoán, việc tăng cường kiểm soát nhập khẩu gia cầm và nỗ lực điều tra nghiên cứu về virus có thể giúp hạn chế sự xâm nhập và lan truyền các gen mới của virus cúm gia cầm độc lực cao ở Việt Nam(Nguyen và cs, 2009) [117].
1.3.3 Sự biến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm khángnguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam
Sự tiến hoá của virus cúm gia cầm H5N1 có thể làm thay đổi tính kháng nguyên, hình thành các nhánh virus khác nhau,ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm phòng vaccine. Từ năm 2001 đến 2007 đã có 6 clade virus cúm gia cầm H5N1 lưu hành tại Việt Nam, bao gồm: clade 0, clade 1, clade 2.3.2, clade 2.3.4, clade 3, clade 5 (Wan và cs, 2008) [152]. Đầu năm 2008, chủng virus cúm A/H5N1 thuộc clade 7 đãđược phát hiện trên gà nhập lậu qua đường Lạng Sơn
(Nguyen và cs, 2009) [117]. Năm 2011,Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) và Tổ
chức Y tế thế giới (WHO) thông báo đã phát hiện các phân nhánh virus cúm
A/H5N1 thể độc lực cao thuộc clade 1.1 và 2.3.2.1 tại Việt Nam (FAOAIDEnews, 2011) [168], (WHO, 2011) [170], (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012) [20]. Các phân nhánh này không phải mới xuất hiện mà được hình thành trong quá trình tiến hoá tự nhiên. Phân nhánh 1.1 có nguồn gốc từ clade 1. Phân nhánh 2.3.2.1
được tiến hóa từ clade 2.3.2(WHO, 2011) [170].
Kết quả nghiên cứu của Long và cộng sự (2011) [103] trên 15 mẫu gia cầm mắc bệnh thu nhận từ các tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng, Khánh Hòa và Bến Tre trong giai đoạn từ tháng 1 đến tháng 3 năm 2010 cho thấy, gen HA của các chủng virus cúm A/H5N1 đã tạo nên một phân nhánh mới so với các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc clade 1. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm gia cầm A/H5N1 thuộc clade 1 tại Việt Nam và Campuchia cho thấy đã có sự hình thành clade 1.1. Từ cuối năm 2010, clade 1.1 được phát hiện ở gia cầm tại các tỉnh phía Nam của Việt Nam, ở gia cầm và người tại Campuchia (WHO, 2011) [170].
Tại các tỉnh phía Nam clade 1 lưu hành suốt từ năm 2003 đến nay; trong khi ở các tỉnh phía Bắc, duyên hải miền Trung và Tây Nguyên luôn có sự thay thế của các clade virus cúm A/H5N1 mới, cụ thể năm 2007 clade 2.3.4 thay thế clade 1, năm 2010 clade 2.3.2 thay thế clade 2.3.4 và tiếp tục lưu hành cho đến nay (Văn
Đăng Kỳ, 2012) [15].
Hiện nay, clade 2.3.2 đã biến đổi và phát triển thành 2 clade phụ (clade 2.3.2.1a và clade 2.3.2.1b) có sự khác biệt lớn về kháng nguyên. Clade phụ 2.3.2.1a lưu hành rộng rãiở hầu khắp các tỉnh Bắc Giang, Bắc Kạn, Bắc Ninh, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa, Hải Phòng, Bình Định, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Quảng Ngãi, Khánh Hòa,Đắk Lắk, Lâm Đồng, Tây Ninh; trong khi đó clade phụ 2.3.2.1b chỉ phát hiện tại Nam Định, Thái Bình, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Kạn và Nghệ An (Văn Đăng Kỳ, 2012) [15].
. Thí nghiệm của Cục Thú y đánh giá độc lực của virus clade 2.3.2 cho thấy, sau khi công cường độc 100% gà bị chết trong vòn g 3 ngày và 20% vịt chết trong vòng 7 ngày. Như vậy, clade virus mới này rất độc đối với gà và ít độc hơn với vịt (clade 1 và clade 2.3.4 có thể gây chết 60-70% vịt) (Văn Đăng Kỳ, 2012) [15].
Vaccine H5N1 Re-1 vẫn có hiệu quả đối với virus clade 1 và clade 2.3.4, đối với clade 2.3.2.1a hiệu quả bảo hộ chỉ đạt khoảng 80% nếu tiêm 1 mũi, còn đối với clade 2.3.2.1b kể cả khi tiêm 2 mũi thì tỷ lệ bảo hộ chỉ đạt 50%. Vaccine H5N1 Re- 5 nếu tiêm 1 mũi thì tỷ lệ bảo hộ đạt 70% với clade 2.3.2.1a và không bảo hộ với clade 2.3.2.1b.
Hiện nay, tại Việt Nam chưa phát hiện virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 ở người. Tuy nhiên, do chưa có vaccine tiêm phòng cho gia cầm đối với clade 2.3.2.1 nên gia cầm hoàn toàn không được bảo hộ miễn dịch tạo điều kiện cho virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 có thể tiếp tục biến đổi trở thành nguy cơ gây bệnh trên người (WHO, 2011) [170], (Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa, 2012) [20]. Do đó, giám sát virus cúm ở gia cầm, áp dụng các biện pháp phòng chống dịch thích hợp là việc làm cần thiết nhằm ngăn chặn sự truyền lây dịch ở gia cầm và từ
gia cầm sang người.
1.4 PHẢN ỨNG RT-PCR TRONG NGHIÊN CỨU VIRUS CÚM A
Hệ gen của virus cúm A là một tập hợp các chuỗi nucleotide phân bố trong các phân đoạn dài ngắn khác nhau. Phương pháp sinh học phân tử sử dụng phản ứng RT-PCR và real-time PCR trong chẩn đoán, giám định, phân loại, giải trình trình tự các phân đoạn và toàn bộ hệ gen, di truyền quần thể, xem xét tiến hóa và nguồn gốc các biến chủng được cho là phương pháp tối ưu trong nghiên cứu virus cúm A gây bệnh ở động vật và người (Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7].RT-PCR có thể sử dụng nhân các gen ”độc” HA và NA, cũng như các gen khung (backbone genes) của virus cúm A để giải trình tự, đối chiếu so sánh thành phần nucleotide của các subtype H và N; phân biệt chủng độc lực cao (HPAI) và chủng độc lực thấp (LPAI) qua phân tích chuỗi nối giữa HA1 và HA2; tìm nguồn gốc tiến hóa của gen HA và biến thể gen của virus cúm A/H5N1 (Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7].
Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuôn RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR, bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn thứ nhất là chuyển đổi RNA một sợi làm khuôn thành DNA (2 sợi) gọi là chuyển đổi cDNA và giai đoạn thứ hai là dùng DNA hai sợi này tiếp tục làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR.
RNA có cấu trúc một sợi bao gồm các nucleotide liên kết với nhau, trong đó có Adenine (A), Guanine (G), Cytosine (C), nhưng Thymine (T) (trong cấu trúc DNA) được thay thế bằng Uracil (U). Chuỗi nucleotide này phải được chuyển đổi thành DNA hai sợi, trong đó thành phần Uracil được thay thế bằng Thymine. Phản ứng này làm biến đổi RNA hệ gen thành DNA phải nhờ đến vai trò của enzym sao chép ngược (Reverse - Transcriptase enzyme), do vậy giai đoạn này được gọi là giai đoạn chuyển ngược, được thực hiện ở 42-45oC hoặc 50-550C. Khi đã có DNA hai sợi làm khuôn chuyển đổi từ RNA ban đầu, phản ứng tiếp theo sẽ là PCR. Toàn bộ phản ứng nhân một đoạn DNA từ khuôn RNA qua hai giai đoạn nói trên, được gọi là phản ứng RT-PCR hay phản ứng PCR ngược.
RT-PCR một bước hoặc RT-PCR hai bước. Trong chẩn đoán và xác định virus cúm A hiện nay phương pháp RT-PCR một bước (one-step RT-PCR) được đánh giá là