Protein của virus cúm A bao gồm: HA, NA, các protein polymerase (PB2, PB1, PA), NP, các protein đệm M1 và M2, và các protein không cấu trúc (NS1 và NS2).
Hai protein HA và NA là các protein chính bề mặt capsid đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A (Murphy và Webster, 1996) [113], (Keawcharoen
và cs, 2005) [87], có vai tròđặc biệt quan trọng trong quá trình gây nhiễm và quyết định tính gây bệnh của virus cúm A. HA và NA có cấu trúc từ glycoprotein, là những gai mấu nhô trên bề mặt của hạt virus, dài 10-14 nm, đường kính 4-6 nm (Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7]. Mỗi hạt virus có khoảng 500 gai nhô ra khỏi lớp vỏ lipid, 80% các gai này là protein HA, 20% là protein NA.
Protein HA
Protein HA là kháng nguyên bề mặt của virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2, có khối lượng phân tử khoảng 63x103Da (nếu không được glycosyl hoá) và 77x103Da (nếu được glycosyl hoá, trong đó HA1 là 48x103Da và HA2 là 29x103 Da) (Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7], (Keawcharoen và cs, 2005) [87]. Protein HA là một glycoprotein thuộc protein màng týp I (lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong toả sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Có 16 phân týp HA đãđược phát hiện (H1-H16, phân týp H16 được tìm thấy ở virus gây bệnh cho hải âu đầu đen - Thụy Điển năm 1999 (Lê Thanh Hòa, 2006) [10], ba phân týp H1, H2 và H3 thíchứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử (Murphy và Webster, 1996) [113].
HA1
HA2
Màng bao lipid kép
Hình 1.6: Mô hình cấu trúc Hemagglutinin (Wagner và cs, 2002) [151]
(Lipid bilayer of envelope:Lớp màng bao lipid kép; 4 Major antigenic variable regions: 4 vùng biến đổi kháng nguyên chính; Receptor site: vị trí gắn với
Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của hạt virus, có vai trò quan trọng trong quá trình nhận diện virus và khởi động quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ (Wagner và cs, 2002) [151]. Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 Å, cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer) (Hình 1.6), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai dưới đơn vị HA1(36 kDa) và HA2(27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau khi tổng hợp, được glycosyl hóa và gắn vào mặt ngoài capsid là dưới đơn vị HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA 1 chứa đựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích (Wagner và cs, 2002) [151].
Chuỗi oligopeptide nối giữa HA1 và HA2 thuộc loại hình motif riêng biệt, đặc trưng cho các biến thể H trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng. Chuỗi oligopeptide này chứa một số amino acid mang tính kiềm làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình phân týp H, làđiểm cắt của enzym protease và cũng chính là vùng quyết định độc lực của virus (Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7], (Horimoto và Kawaoka, 2005) [78], (Gambotto và cs, 2008) [65]. Sự biến đổi thành phần của chuỗi nối quyết định tính độc lực của virus thuộc biến chủng mới. Nếu ở điểm cắt của enzym protease càng có nhiều amino acid kiềm thì khả năng HA được phân cắt càng lớn, và quá trình xâm nhập nội bào nhanh dẫn đến tăng độc lực của virus cúm A (Webster, 1998) [156]. Đối với các chủng chứa gen HA (H5) cường độc (ví dụ, phân týp H5N1) cấu trúc của chuỗi nối là TPQRERRRKKR (Hình 1.7), trong đó RRRKK quyết định tính gây bệnh của H5N1.
Đối với phân týp H5N2 chuỗi nối này có cấu trúc VPQRKRKTR. Đối với các phân týp H vô độc (hoặc nhược độc) như H5N1, H5N2, H5N3, H4N6 và H11N1, motif của chuỗi nối này có cấu trúc là VPQRETR (Horimoto và Kawaoka,
2001) [77].
Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa acid sialic) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trê n vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình
không gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau (Webster, 1998) [156], (Wagner và cs, 2002) [151], (Jiang và cs, 2010) [85]. H5N1 [HPAI] (Độc lực cao) H5N2 [HPAI] (Độc lực cao) H5N1, H5N2, H5N3 H4N6, và H11N1 [LPAI] (Độc lực thấp) Chủng virus TPQRERRRKKR VPQRETR VPQRKRKT R Thành phần chuỗi nối HA1và HA2
Hình 1.7: Sự biến đổi amino acid chuỗi nối HA1 và HA2 (điểm cắt của protease) quy định độc lực của virus cúm A (Lê Thanh Hòa, 2006) [10]
Vị trí amino acid 226 của dưới đơn vị HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là glycin, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa acid sialic liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc quay α- 2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A).Ở các chủng virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2 vị trí này trên protein HA là Leucin, thích ứng với thụ thể Gal α-2,6 sialic acid có mặt ở tế bào biểu mô đường hô hấp dưới của người (Vines, 1998) [150]. Các tế bào cảm thụ với virus cúm A của lợn có cả hai loại thụ thể này, do đó lợn được coi là vật chủ trung gian tạo điều kiện để virus cúm A tiến hóa thích ứng lây nhiễm sang người (Vines, 1998) [150].
Hiện tượng glycosyl hóa thường xảy ra trong protein HA. Các vị trí glycosyl hóa liên quan đến khả năng gắn kết với kháng thể do protein HA kích thích sinh ra dẫn đến phong tỏa miễn dịch (Nguyễn Mạnh Kiên và cs, 2008) [13], do đó ảnh
[67] cho thấy, sự biến đổi một amino acid trong protein HAở vị trí 160 (T160A) đã làm mất glycosyl hóa ở vị trí 158-160, là vị trí gắn kết của HA với sialic glycan cần thiết để virus H5N1 truyền lây bệnh trên chuột lang.
Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác: glutamin 222, glycin 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa acid sialic bề mặt màng tế bào chủ (Keawcharoen và cs, 2005) [87]. Đặc biệt, một số chủng virus cường độc A/H5Nx, A/H7Nx lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người khi chúng có tải lượng cao trong đường hô hấp (do tiếp xúc trực tiếp với chất thải hay gia cầm nhiễm bệnh) (Webster, 1998) [156], (Bauer và cs, 2006) [39], (Hui, 2008) [81].
Trình tự mã hóa chuỗi nối, thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA (Keawcharoen và cs, 2005) [87]. Protein HA chứa các epitope trung hòa chủ yếu, là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng phân týp HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus, được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay (Matrosovich và cs,
1999) [108], (Keawcharoen và cs, 2005) [87], (Horimoto và Kawaoka, 2006) [79], (Jiang và cs, 2010) [85], (Nayak và cs, 2010) [114].
Protein NA
Protein NA là một protein enzym có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân týp NA (Baigent và Cauley, 2001) [37], (Wagner và cs, 2002) [151]. Có 9 phân týp (từ N1 đến N9) được phát hiện chủ yếu ở virus cúm gia cầm, hai phân týp N1 và N2 được tìm thấy ở virus cúm người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử
(Webster, 1998) [156]. Có khoảng 100 phân tử NA xen giữa các phân tử HA trên bề mặt capsid hạt virus. Phân tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng
hoạt động) gồm 4 dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng, và phần kỵ nước gắn vào vỏ capsid (Castrucci và Kawaoka, 1993) [42], (Wagner và cs, 2002) [151]. Các nghiên cứu phân tử cho thấy phần đầu gen N1 (đầu 5') của virus cúm A/H5N1 có mức độ biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng virus, liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của chúng trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau(Matrosovich và cs, 1999) [108], (Keawcharoen và cs, 2005) [87].
Protein NA có vai trò là một enzym cắt đứt liên kết giữa gốc acid sialic của màng tế bào nhiễm với phân tử carbohydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. Mặt khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình “cởi
áo” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá
trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn (Wagner và cs, 2002) [151]. Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng acid neuraminic làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các ch ất ức chế không đặc hiệu. Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ. Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hoá dược ức chế virus không đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzym này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ thể (Castrucci và Kawaoka, 1993) [42], (Aoki và cs, 2007) [36]. Một số nghiên cứu cho thấy, các đột biến khác nhau trong gen NA có ảnh hưởng đến tính mẫn cảm của virus đối với Oseltamivir, Zanamivir và Peramivir (một loại hóa dược mới được FDA cấp phép sử dụng chống cúm A/H1N1 theo đường tĩnh mạch) (Abed và cs, 2002) [33]. Sự thay đổi một amino acid ở vị trí 274 (H274Y) (de Jong và cs, 2005b) [53]hoặc vị trí 294 (N294S) (Kiso và cs, 2011) [89]
trong protein NA có thể làm gia tăng tính kháng Oseltamivir và ảnh hưởng đáng kể đến tính gây bệnh của virus cúm A/H5N1 ở người.
thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA
(Doherty và cs, 2006) [57]. Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A, và là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người (Suarez và
Schultz-Cherry, 2000) [139], Wu và cs, 2008b.
Protein PB2, PB1, PA là các enzym cấu thành phức hợp polymerase (RNA
transcriptase) của virus, có độ dài tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A,
bao gồm:
Protein PB2 của H5N1 gồm có 759 amino acid, là tiểu đơn vị thành phần
trong phức hợp enzym polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus; có trọng lượng phân tử theo tính toán khoảng 84x103Da (trên thực tế là 87x103Da) (Murphy và Webster, 1996) [113]. Protein PB2 góp phần làm tăng độc lực của virus cúm A/H5N1ở trên gà(Tada và cs, 2011) [145]. Vị trí amino acid 627 ở protein PB2 được cho là có liên quan đến tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ và độc lực của virus. Ở virus cúm gia cầm vị trí này là E, cònở virus thích nghi trên người là K (Horimoto và Kawaoka, 2005) [78], (Wasilenko và cs, 2008) [155]. Ở chủng virus cúm A/H5N1 độc lực thấp vị trí này là glutamic acid cònở chủng độc lực cao là lysin (Hatta và cs, 2001) [73]. Sự có mặt của lysin làm cho virus nhân lên mãnh liệt hơn, lấn át các cơ chế bảo vệ của tế bào chủ, và do đó gây tỷ lệ chết cao
(Shinya và cs, 2004) [134]. Chủng virus H5N1 chứa lysin ở vị trí 627 trong PB2 có khả năng nhân lên trong nhiều loại tế bào (bao gồm cả tế bào đường hô hấp trên) cao hơn và ở giới hạn nhiệt độ thấp hơn so với các phân lập virus chứa glutamic acidở vị trí này (Hatta và cs, 2007) [74]. Thay thế K bằng E ở vị trí 627 sẽ làm giảm sự kết hợp giữa PB2 và NP, kết quả là làm giảm quá trình phiên mã, sao mã, và giảm số lượng virus trong các tế bào của động v ật linh trưởng (Mehle và Doudna, 2008) [109]. Tuy nhiên, đột biến E627K của PB2 không phải là yếu tố không thể thiếu để virus H5N1 thích nghi gây bệnh ở động vật có vú (Li và cs, 2009) [96]. Ngoài ra,
amino acid asparagin ở vị trí 701 trong PB2 cũng liên quan đến tính gây bệnh của virus cúm A/H5N1(Li và cs, 2005) [98], (Gabriel và cs, 2008) [64]. Asparaginở vị trí 701 là điều kiện tiên quyết để virus cúm A/H5N1 gây bệnh ở chuột lang (Gao và cs, 2009) [67]. Ở các chủng virus H5N1 độc lực cao trong thành phần của protein PB2 phát hiện có lysin ở vị trí 627 hoặc tổ hợp 627E/701N (Li và cs, 2010) [100]. Lysinở vị trí 627 của PB2 (627K) là yếu tố quyết định độc lực chính ở virus H5N1 thuộc nhóm kháng nguyên (clade) 2.3.4, trong khi asparaginở vị trí 701 của PB2 và các yếu tố độc lực chưa được biết khác liên quan đến độc lực của virus H5N1 thuộc nhóm kháng nguyên 1ở động vật có vú (Le và cs, 2010) [94].
Protein PB1 bao gồm 757 amino acid, mã hoá tổng hợp enzym PB1 - tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA (Murphy và Webster, 1996) [113]. Gần đây, người ta đã phát hiện thêm một protein (PB1-F2), bao gồm 90 amino acid được mã hóa bởi một khung đọc mở khác của gen PB1, có vai trò gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) (Uiprasertkul và cs, 2007) [149]. PB1-F2 làm cho tế bào nhiễm nhạy cảm với các tác nhân kích thích như TNF-α thông qua phức hợp lỗ thấm của ty thể (Zamarin và cs, 2005) [163]. PB1-F2 còn gây chết tế bào miễn dịch theo chương trình, kết quả là làm giảm trình diện kháng nguyên dẫn đến đáp ứng miễn dịch thích nghi không đầy đủ (Conenello và cs, 2007) [50]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy một đột biến trong protein PB1-F2, serin (S) thay cho asparagin (N)ở vị trí 66, đã làm tăng tính gây bệnh của virus cúm A/H5N1 (Korteweg và Gu,
2008) [90].
Protein PA là một protein enzym, bao gồm 716 amino acid, khối lượng phân
tử theo tính toán khoảng 83x103Da (trên thực tế là 96x103Da). PA là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, c ác đột biến T515A trong PA và Y436H trong PB1 đã làm mất tính gây bệnh của virus H5N1 (Hulse-Post và cs, 2007) [82], nhưng chỉ đột biến riêng lẻ ở các amino acid này thì khôngảnh hưởng đến độc lực của virus. Mặt khác, hai đột biến S224P và N383D trong PA cũng góp
phần làm gia tăng độc lực của virus cúm A/H5N1 trên vịt. Điều này chứng tỏ protein PA cũng là một yếu tố độc lực của virus cúm A/H5N1 (Song và cs, 2011) [138].
Như vậy, phức hợp polymerase được cấu thành từ 3 protein polymerase (PB1, PB2 và PA) tham gia vào quá trình tổng hợp RNA của virus. Cùng với NP, các protein polymerase tạo nên ribonucleoprotein (Horimoto và Kawaoka, 2001) [77]. Các phân đoạn gen được NP bao bọc tạo điều kiện cho phức hợp polymerase nhận diện chúng (Horimoto và Kawaoka, 2001) [77]. Phức hợp gen polymerase là yếu tố phân tử quan trọng quyết định độc lực của virus cúm A (Hatta và cs, 2001) [73], (Salomon và cs, 2006) [128].
NP, MA và NS là các protein chức năng khác nhau của virus cúm A, bao
gồm:
Protein NP có độ dài khoảng 498 amino acid, tương đối ổn định giữa các
chủng virus cúm A. NP là thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương t ế bào chủ. NP là một protein được glycosyl hóa, có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA, có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 56x103Da (trên thực tế là 50 -60x103Da)(Murphy và Webster, 1996) [113], (Salzberg và cs, 2007) [129]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy NP góp phần làm gia tăng độc lực của virus cúm A/H5N1 và amino acid valinở vị trí 105 có thể là một trong những yếu tố quyết định khả năng thích nghi gây bệnh của virus trên gà
(Tada và cs, 2011) [145].
Protein MA là protein đệm (matrix protein) của virus, gồm hai tiểu phần là
M1 và M2 được tạo ra bởi những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA. Cùng với HA và NA có khoảng 3000 phân tử MA trên bề mặt capsid của