1.3. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ
1.3.5. Một số phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào ung thư
a. Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethylthiozol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) Phương pháp này lần đầu tiên được mô tả bởi Mosmann T. trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 [175]. Tác giả sử dụng muối tetrazolium (MTT) làm thuốc thử trong phép so màu để đánh giá sự sống sót của tế bào. Khi có mặt của enzym dehydrogenase trong ty thể của tế bào sống, MTT có màu vàng sẽ bị biến đổi thành formazan có màu tím, chất này có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 570 nm. Do đó, mức độ sản xuất formazan tương ứng với số lượng tế bào sống sót và tỷ lệ nghịch với mức độ gây độc tế bào.
Ưu điểm: Ít bước hơn, sử dụng ít vật liệu hơn. Nhược điểm:
Cần tối ưu hóa số lượng tế bào nuôi cấy và thời gian thử nghiệm để đạt kết quả tốt nhất.
Protein kết tủa và các mảnh vụn tế bào trong giếng nuôi cấy có thể gây sai số thực nghiệm do ảnh hưởng đến kết quả quang học.
b. Phương pháp MTS (3-(4,5-dimethylthiozol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4- ulphophenyl-2H-tetrazolium)
Khi có mặt PMS (phenazin methosulphat), MTS được enzym dehydrogenase trong ty thể tế bào sống chuyển hóa thành formazan màu tím, hòa tan trong môi trường nuôi cấy tế bào và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 490 - 500 nm trong đệm FBS. Lượng
formazan tạo ra được định lượng bằng phương pháp đo quang ở 490 nm. Phương pháp này tiện lợi vì chỉ cần thêm trực tiếp chất vào môi trường nuôi cấy tế bào, không cần bất kỳ bước rửa hay chuẩn bị nào khác, giảm thiểu sai sót do thao tác. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks A. năm 1991 [176].
Ưu điểm:
Đơn giản: MTS hiệu quả hơn MTT và tạo ra formazan hòa tan trong nước, không cần hòa tan bằng DMSO.
Độ nhạy cao: MTS tạo ra sản phẩm formazan sẫm màu hơn nên phạm vi giá trị độ hấp thụ nhạy hơn và chính xác hơn cũng như dễ dàng đánh giá kết quả dương tính hơn.
Thời gian thực hiện nhanh: Chỉ cần 2-3 giờ cho phản ứng, trong khi MTT cần 4 giờ.
Độ lặp lại tốt: Kết quả ổn định và đáng tin cậy.
Nhược điểm:
Chi phí cao hơn: Thuốc thử MTS đắt hơn so với MTT.
c. Phương pháp XTT (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium 5- carboxanid)
Các xét nghiệm đo màu phân tích số lượng tế bào sống bằng cách phân tách muối tetrazolium trong môi trường nuôi cấy. Kỹ thuật này không yêu cầu rửa hay thu hoạch tế bào và toàn bộ quá trình, từ nuôi cấy vi mô đến phân tích dữ liệu bằng đầu đọc ELISA, được thực hiện trong cùng một đĩa vi mô [177]. Tế bào trong đĩa 96 giếng được ủ với hỗn hợp XTT từ 2 đến 20 giờ. Sau giai đoạn ủ, formazan tạo thành được định lượng bằng máy quang phổ ELISA. Không giống như MTT, sản phẩm phân tách của XTT hòa tan trong nước nên không cần bước hòa tan. Muối tetrazolium được phân cắt thành formazan nhờ hệ thống succinat-tetrazolium reductase (EC 1.3.99.1) thuộc chuỗi hô hấp của ty thể và chỉ hoạt động trong các tế bào nguyên vẹn về mặt trao đổi chất. Quá trình khử sinh học này liên quan đến việc sản xuất NAD(P)H thông qua quá trình đường phân, do đó, lượng formazan hình thành tương quan trực tiếp với số lượng tế bào có hoạt động trao đổi chất trong môi trường nuôi cấy.
Phương pháp này có một số ưu điểm:
An toàn và dễ thực hiện: Loại bỏ nhu cầu sử dụng các đồng vị phóng xạ, các bước rửa và thuốc thử bổ sung.
Chính xác: Độ hấp thụ thu được tương quan chặt chẽ với số lượng tế bào.
Nhạy cảm: Có thể phát hiện được số lượng tế bào thấp.
Nhanh chóng: Xử lý số lượng lớn mẫu bằng đầu đọc ELISA nhiều giếng.
d. Phương pháp WST-1 (4[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-tetrazolio]-1-3- benzen disulfonat)
Phương pháp WST-1 cũng có nguyên tắc tương tự như các phương pháp trên [178]. Thuốc thử tăng sinh tế bào WST-1 được thiết kế để định lượng quang phổ, không phóng xạ về sự tăng sinh, tăng trưởng, khả năng sống sót và độ nhạy hóa học của tế bào trong các quần thể tế bào sử dụng đĩa 96 giếng. Nó có thể được sử dụng để:
Đo lường mức độ tăng sinh tế bào nhằm đáp ứng với các yếu tố tăng trưởng, cytokin và chất dinh dưỡng.
Đánh giá hiệu quả của các kháng thể ức chế sự tăng trưởng và các chất trung gian sinh lý.
Phân tích độc tính tế bào và tác dụng ức chế của các hợp chất, chẳng hạn như thuốc chống ung thư và các chất hóa học khác.
1.3.5.2. Phương pháp nhuộm sulforhodamin B (SRB)
Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamin B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn [179].
Ưu điểm:
Vì tế bào đã được cố định, nên nhuộm SRB ít bị ảnh hưởng bởi các hợp chất khác và có thể bảo quản trong thời gian dài.
Dung dịch SRB hòa tan với Tris-base cũng ổn định trong thời gian dài, do đó các đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng ở các thời điểm khác nhau có thể được phân tích đồng thời.
Nhược điểm:
Thử nghiệm SRB chủ yếu được áp dụng trong sàng lọc thủ công hoặc bán tự động do nhiều bước rửa và sấy khô, không thể tự động hóa.
Quy trình thực hiện phức tạp.
1.3.5.3. Các phương pháp khác a. Thử nghiệm khử resazurin
Các công thức khác nhau của resazurin ngày càng phổ biến để đánh giá tình trạng sống sót của tế bào trong quá trình sàng lọc thuốc. Một sản phẩm thương mại nổi tiếng, Alamar Blue, chứa resazurin và có thể bao gồm một hỗn hợp các muối ổn định để giảm thiểu sự thay đổi màu nền tự nhiên khi không có tế bào. Các thử nghiệm resazurin dựa trên việc tế bào sống khử chất nhuộm xanh bị oxy hóa thành sản phẩm huỳnh quang màu hồng resorufin. Thử nghiệm này cũng có thể được theo dõi bằng độ hấp thụ, mặc dù độ nhạy có thể giảm nhẹ. Việc khử resazurin được thực hiện bởi enzym reductase hoặc diaphorase từ ty thể và bào tương [180].
PrestoBlue là một chất đo màu dựa trên resazurin được sử dụng gần đây, có tính linh hoạt cao vì kết quả thử nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường, đo bằng độ hấp thụ hoặc đọc tín hiệu huỳnh quang của sản phẩm resorufin đã khử. PrestoBlue là một phương pháp nhanh chóng và trực tiếp để đo khả năng sống sót của tế bào, với thời gian ủ chỉ khoảng 10 phút. Phương pháp này rất nhạy, có thể phát hiện tối đa 12 tế bào trên mỗi giếng. Tuy nhiên, thời gian để màu phát triển sau khi thêm PrestoBlue vào tế bào phụ thuộc vào tốc độ trao đổi chất của các vi khuẩn và dòng tế bào khác nhau được thử nghiệm [180].
b. Thử nghiệm phát quang sinh học ATP
Phương pháp đo nồng độ ATP trong tế bào in vitro được sử dụng rộng rãi như một chỉ số đáng tin cậy để xác định số lượng tế bào hiện diện. Các tế bào nhân chuẩn khi phát triển trong môi trường nuôi cấy sẽ duy trì mức ATP ổn định để đảm bảo cân bằng nội môi. Khi tế bào chết, chúng mất khả năng sản xuất ATP và enzym ATPase nội sinh sẽ phân hủy lượng ATP còn lại. Phương pháp phổ biến nhất để đo ATP dựa trên khả năng của enzym luciferase tạo ra tín hiệu phát quang. Đây được coi là xét nghiệm nhạy nhất trên vi đĩa để phát hiện các tế bào sống đang phát triển trong môi trường nuôi cấy, vì nó có thể phát hiện được ít hơn 10 tế bào trên mỗi giếng, chủ yếu do mức độ phát quang nền thấp trong các mẫu sinh học [180].