CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học
2.3.1.1. Phương pháp xác định hàm lượng và thành phần tinh dầu a) Xác định hàm lượng tinh dầu
Tinh dầu trong dược liệu được định lượng bằng phương pháp cất kéo hơi nước theo Phụ lục 12.7 của Dược điển Việt Nam V [181]. Bộ dụng cụ cất tinh dầu là bộ cất Clevenger, nhánh chưng cất tinh dầu 10 mL có chia vạch đến 0,1 mL.
Tiến hành:
- Cân dược liệu sau đó cho vào bình cầu và thêm nước vào bình với tỉ lệ dược liệu/nước là 1:7 g/mL.
- Lắp đặt bộ dụng cụ với giá và bếp rồi tiến hành cất đến khi lượng tinh dầu thu được ở bộ phận hứng không tăng lên nữa (khoảng 3 giờ) thì dừng cất, đọc thể tích tinh dầu.
-Tinh dầu được làm khan bằng Na2SO4 và bảo quản trong tủ lạnh (4°C) cho đến khi phân tích.
- Độ ẩm của dược liệu được xác định bằng phương pháp sấy theo Phụ lục 9.6 của Dược điển Việt Nam V [182].
- Độ lặp lại: 3 lần.
- Hàm lượng tinh dầu (% thể tích/khối lượng) được tính theo công thức:
V. 10 4 Trong đó:
H (%)
= M. (100 − X)
H: Hàm lượng tinh dầu (%) V: Thể tích tinh dầu cất được (mL) M: Khối lượng dược liệu đem cất (g) X: Độ ẩm của dược liệu (%) b) Xác định thành phần của tinh dầu
Sắc ký khí ghép nối khối phổ gồm có thiết bị sắc ký khí (GC) kết nối với detector khối phổ (MS). Mẫu sau khi được tách trên cột phân tích của thiết bị sắc ký khí sẽ được detector khối phổ nhận biết. Hiện nay phương pháp này được áp dụng phổ biến để định tính (dựa vào chỉ số lưu giữ (RI) và dựa vào các mảnh khối phổ) và định lượng (dựa vào phần trăm diện tích pic) các thành phần dễ bay hơi [183].
Hệ thống máy sắc ký GC-MS:
+ Thiết bị GC: Agilent GC 7890B.
+ Thiết bị MS: Agilent MSD 5977B.
+ Cột GC: HP-5MS UI (30 m ì 0,25 mm ì 0,25 àm i.d., Aligent Technologies).
+ Khí mang được sử dụng là Heli, tốc độ 1,0 mL/phút.
+ Thể tích tiêm mẫu 1,0 μL, chia dòng 25:1.
Tiến hành:
+ Pha loãng với DCM, tỷ lệ thể tích tinh dầu/dung môi là 1/100 (v/v).
+ Khởi động hệ thống GC-MS.
+ Chương trình nhiệt được thiết lập như sau: Ban đầu, nhiệt độ lò GC được giữ ở 60°C trong 1 phút, sau đó tăng lên 240°C với tốc độ 4°C/phút, cuối cùng giữ nhiệt độ ở 240°C trong 4 phút.
+ Điều kiện phổ khối MS: Dòng điện ion hoá 70 eV, dải phổ khối từ 50 - 550 m/z, tốc độ 2 lần quét/giây.
+ Các thành phần hoá học có trong mẫu tinh dầu được xác định dựa trên việc so sánh phổ khối và RI của chúng với ngân hàng dữ liệu NIST17 và sách Adams [184].
+ Chỉ số lưu giữ, hay còn gọi là hệ số lưu của các thành phần được xác định bởi dãy đồng đẳng n-alkan (C7 – C30, Merck) trong cùng điều kiện phân tích với mẫu nghiên cứu. Chỉ số lưu giữ của một cấu tử X được tính theo công thức sau:
Trong đó:
RI = 100 × [n + (N − n) × (logRTX − logRTn) logRTN − ]
logRTn + RT: Thời gian lưu của hợp chất tương ứng.
+ N: Số nguyên tử carbon trong phân tử alkan lớn.
+ n: Số nguyên tử carbon trong phân tử alkan bé.
Hàm lượng của mỗi cấu tử được tính theo công thức sau:
𝑆𝑛 Trong đó:
P(%) = 𝑆 ∑
× 100
+ P: Hàm lượng của cấu tử n (%).
+ Sn: Diện tích pic của cấu tử n.
+ Si: Diện tích pic của các thành phần có trong tinh dầu.
2.3.1.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất
Chiết xuất:
- Tạo cao chiết toàn phần: Dược liệu được chiết ngâm ở nhiệt độ phòng với EtOH 70% (3 ngày/lần × 3 lần), thu được dịch chiết toàn phần. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao EtOH 70% [185].
- Tạo các cao chiết phân đoạn: Phân tán cao EtOH 70% trong nước, tiến hành chiết lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần là n-hexan và EtOAc. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm lần lượt thu được cao phân đoạn tương ứng: cao n-hexan, cao EtOAc và cao nước [185].
Phân lập và tinh chế:
Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột với các chất nhồi cột khác nhau (silica gel và RP-C18) và các hệ dung môi rửa giải khác nhau; theo dõi phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) kết hợp soi UV ở hai bước sóng 254 và 365 nm hoặc dùng thuốc thử (dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96%); kiểm tra độ tinh khiết bằng TLC hoặc phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [186].
Xác định cấu trúc:
Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được xác định dựa trên các dữ liệu phổ như phổ khối lượng (MS), phổ NMR (1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC, COSY và NOESY) và phổ CD đồng thời kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [187], [188].
��
2.3.1.3. Phương pháp xác định các thành phần bay hơi trong cao n-hexan
Các thành phần bay hơi trong cao n-hexan của thân rễ (RH) và phần trên mặt đất (APH) Nghệ đắng được xác định bằng phương pháp GC-MS [189], [190] tương tự như phương pháp trong mục 2.3.1.1 với một số thay đổi nhỏ như sau:
+ Xử lý mẫu: Cao chiết được hòa tan trong n-hexan (Merk, Đức), sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc thu được dịch chiết n-hexan đã loại tạp thô. Dịch chiết này được loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn n-hexan. Hòa tan cắn bằng dung môi n- hexan (Merk, Đức) (tỷ lệ 1:1, mg/mL), sau đú lọc qua màng lọc 0,22 àM để thu được dung dịch phân tích có nồng độ 1000 ppm.
+ Tốc độ của dòng khí mang (Heli) là 1,2 mL/phút.
+ Cài đặt chương trình nhiệt độ như sau: Ban đầu, nhiệt độ lò GC được giữ ở 80°C trong 1 phút, sau đó tăng lên 300°C với tốc độ 20°C/phút, cuối cùng giữ nhiệt độ ở 300°C trong 15 phút.
2.3.1.4. Phương pháp định lượng một số hợp chất trong thân rễ và phần trên mặt đất a. Chuẩn bị các dung dịch mẫu
-Dung dịch (1R,4S,5S,10R)-zedoarondiol 1 mg/mL: cân chính xác khoảng 5 mg chất đối chiếu (1R,4S,5S,10R)-zedoarondiol, hòa tan và định mức trong bình định mức 5 ml bằng MeOH.
- Dung dịch curdion 1 mg/mL: chuẩn bị tương tự như dung dịch đối chiếu (1R,4S,5S,10R)-zedoarondiol.
-Dung dịch hỗn hợp chất đối chiếu: từ dung dịch đối chiếu có nồng độ 1 mg/mL trên, tiến hành pha loãng thành dãy dung dịch hỗn hợp chất đối chiếu có nồng độ của (1R,4S,5S,10R)-zedoarondiol từ 2,32 – 297,50 μg/mL và curdion từ 4,30 – 550,00 μg/mL. Các dung dịch đối chiếu này được bảo quản ở nhiệt độ 4°C, sử dụng ổn định trong 01 tháng.
-Dung dịch mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột mẫu thử (đã xác định độ ẩm) vào bình tam giác dung tích 100 mL; thêm 50 mL MeOH, sau đó tiến hành chiết siêu âm trong 30 phút. Để yên 10 phút, lọc dịch chiết vào bình định mức 50 mL, bổ sung đến vạch mức bằng MeOH, lắc đều, thu được dung dịch mẫu thử. Dung dịch này được lọc qua màng 0,45 àm thu được mẫu thử dựng cho phõn tớch HPLC [191].
b. Điều kiện phân tích HPLC-DAD [191]
Cột: Cột sắc ký C18 của hãng Agilent, kích thước cột 250 × 4,6 mm, kích thước hạt 5 àm.
Detector: DAD quan sát ở bước sóng 214 nm đối với curdion và bước sóng 254 nm đối với (1R,4S,5S,10R)-zedoarondiol.
Pha động: ACN và nước.
Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút.
Thể tớch tiờm: 10 àL.
Chương trình rửa giải:
Thời gian (phút) ACN (%) Nước (%)
0 - 20 5 - 47 95 - 53
20 - 30 47 53
30 - 40 47 - 60 53 - 40
40 - 55 60 - 90 40 - 10
55 - 65 90 - 100 10 - 0
c. Thẩm định phương pháp định lượng HPLC-DAD
Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng (1R,4S,5S,10R)-zedoarondiol và curdion trong dược liệu Nghệ đắng bằng HPLC-DAD theo hướng dẫn của ICH [192]
và có tham chiếu theo AOAC [193], gồm các đánh giá về: độ đặc hiệu, đường chuẩn, tính thích hợp của hệ thống, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại và độ đúng.
d. Tính kết quả
Hàm lượng (1R,4S,5S,10R)-zedoarondiol và curdion trong mẫu thử được tính toán theo công thức:
C × V × 100 × P
X (%) = × 100
m × 106 × (100 – B) Trong đó:
X (%): Hàm lượng của chất phân tích có trong mẫu thử.
C: Nồng độ của chất phân tích có trong dung dịch mẫu thử tính từ phương trình đường chuẩn (àg/mL).
V: Thể tích dung môi dùng để chiết mẫu (mL).
m: Khối lượng mẫu thử (g).
B: Độ ẩm của mẫu thử (%).
P: Độ tinh khiết của các chất đối chiếu (%).