Nhằm lựa chọn chất mang phù hợp nhất cho chế phẩm, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thí nghiệm các cơ chất là than bùn, cám ngô, bột đậu tương. Tiến hành phối trộn các chất mang theo tỷ lệ (60: 30: 10; 50:40:10; 70:20:10) với tổng khối lượng đều bằng 10g, sau đó cho vào các bình 250ml mang đi thanh trùng ở 105oC trong 30 phút, để nguội. Từng chủng xạ khuẩn được nhân giống cấp 1, cấp 2 trong bình tam giác, rồi bổ sung 10% giống cấp 2 vào các bình hỗn hợp chất mang, trộn đều, nuôi trong tủ ấm 30oC. Sau 5 ngày đem các bình chứa 2 chủng xạ khuẩn tương ứng với các tỷ lệ ra tiến hành pha loãng tới nồng độ pha loãng là 10-4, hút 100µl dịch ở nồng độ pha loãng 10-4 và tiến hành cấy trải mỗi bình vào 2 đĩa thạch đã chuẩn bị sẵn(có đánh dấu từng chủng tương ứng với tỷ lệ phối trộn), nuôi ở tủ ấm 28- 30oC, sau 5- 7 ngày đem ra đếm số lượng khuẩn lạc. Thông qua kết quả số lượng khuẩn lạc trung bình, có thể lựa chọn tỷ lệ các cơ chất nào phù hợp nhất.
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp
Tiến hành thí nghiệm, lọc thu sinh khối và dịch lọc enzyme. Sinh khối đem sấy khô ở 45oC đến trọng lượng không đổi, dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường cellulose, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase, protease của các chủng xạ khuẩn. Dựa vào kết quả lượng sinh khối cao nhất và kết quả đường kính vòng phân giải D – d(mm) cao nhất sẽ lựa chọn môi trường phù hợp nhất để làm môi trường lên men và môi trường sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả lựa chọn môi trường làm môi trường lên men và môi
trường sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo phụ thuộc vào lượng sinh khối khô(mg/ml) thu được thể hiện ở bảng 4.1 và hình 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả lượng sinh khối khô thu được trong 20ml môi trường
Chủng Gause I Sinh khối khô (mg)Gause II ISP - 4
T1 7,56 5,12 4,65
T4 7.72 6,24 3,78
Kết quả ở bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy lượng sinh khối khô thu được trong 20ml dịch của chủng Streptomyces sp. T1 lên men trong môi trường Gause I là 7,56(mg), trong môi trường Gause II là 5,12(mg), trong môi trường ISP – 4 là 4,65(mg) và của chủng Streptomyces sp. T4 trong môi trường lên men Gause I, Gause II , ISP – 4 lần lượt là 7,7 2(mg), 6,24(mg), 3,78(mg).Như vậy, lượng sinh khối khô thu được cao nhất của cả 2 chủng đều trong môi trường Gause I. So sánh trong môi trường Gause I thấy lượng sinh khối khô thu được của chủng Streptomyces sp. T1 thấp hơn lượng sinh khối khô thu được của chủng Streptomyces sp. T4 là 0,169(mg). Qua kết quả trên chúng tôi thấy môi trường Gause I thích hợp nhất cho cả 2 chủng sinh trưởng.
Kết quả lựa chọn môi trường nào thích hợp nhất làm môi trường lên men và môi trường sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo phụ thuộc trong môi trường đó kết quả đường kính vòng phân giải D – d(mm) cao nhất thể hiện ở bảng 4.2 và hình 4.2
Bảng 4.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của môi trường lên hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn (đường kính vòng phân giải D-d, mm).
Chủng xạ khuẩn Hoạt tính cellulase (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Gause I Gause II ISP - 4
T1 17 13 12
T4 16 11 14
Chủng xạ khuẩn Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Gause I Gause II ISP - 4
T1 14 12 11
T4 13 11 12
Chủng xạ khuẩn Hoạt tính protease(đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Gause I Gause II ISP - 4
T1 13 9 10
Hình 4.2. Kết quả ảnh hưởng của môi trường lên sinh tổng hợp enzym của các chủng xạ khuẩn (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Kết quả trên bảng 4.2 và hình 4.2 cho thấy trong 3 môi trường lên men, dịch lên men ở cả 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều cho hoạt tính enzyme lớn nhất trong môi trường Gause I. Từ kết quả này đã chứng tỏ các thành phần trong môi trường lên men có ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh và hoạt tính enzyme của xạ khuẩn như nhiều nghiên cứu đã khẳng định( Nguyễn Văn Cách ,2004, Công nghệ lên men các chất kháng sinh),[3].
Với mục đích lựa chọn môi trường lên men thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và sinh enzyme, căn cứ vào kết quả này tôi thấy môi trường Gause I là thích hợp nhất và được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.2. Kết quả một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng và sinh enzyme của2 chủng xạ khuẩn 2 chủng xạ khuẩn
4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh enzyme. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn phụ thuộc vào kết quả lượng sinh khối khô thu được trong 20ml dịch môi trường thể hiện ở bảng 4.3, hình 4.3
Bảng 4.3. Kết quả sinh khối khô trong 20 ml dịch môi trường
Chủng Sinh khối khô (mg)
xạ khuẩn 20oC 30oC 37oC 45oC 50oC 55oC
T1 13,04 15,65 13,48 14,05 5,13 0,98
Hình 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng
Kết quả ở bảng 4.3 và hình 4.3 cho thấy các chủng xạ khuẩn tuyển chọn sinh trưởng mạnh trong dải nhiệt độ từ 30 đến 50oC, nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất là 30oC. Khi nhiệt độ nuôi dưới 20oC và cao hơn 50oC thì các chủng xạ khuẩn phát triển yếu. Điều này cho thấy các chủng xạ khuẩn tuyển chọn đều là các chủng ưa nhiệt.
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh tổng hợp enzym
của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Chủng Hoạt tính cellulase (đường kính vòng phân giải D-d, mm) 20oC 30oC 37oC 45oC 50oC 55oC
T1 10 22 21 19 6 0
T4 11 21 20 17 8 0
Chủng Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm) 20oC 30oC 37o C 45oC 50oC 55oC
T1 10 24 23 15 13 3
T4 9 18 18 12 9 1
Chủng Hoạt tính protease(đường kính vòng phân giải D-d, mm) 20oC 30oC 37oC 45oC 50oC 55oC
T1 13 32 30 27 14 2
Hoạt tính cellulase (Đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Hoạt tính protease (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Hình 4.4. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn (đường kính vòng phân giải D-d, mm )
Kết quả trình bày ở bảng 4.4 và hình 4.4 cho thấy các chủng xạ khuẩn tuyển chọn có khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase, amylase và protease dải nhiệt độ từ 30oC đến 45oC và chúng sinh tổng hợp enzym cellulase, amylase và protease tối ưu ở nhiệt độ là 30oC. Nếu nhiệt độ nuôi xuống dưới 20oC và cao hơn 50oC thì khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase, amylase và protease của tất cả các chủng vi sinh vật đều yếu. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng của vi sinh vật cũng trùng với nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp enzym của chúng.Các chủng xạ khuẩn đều thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm, nhiệt độ sinh enzyme có thể lên đến 45oC.
Qua kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ thích hợp nhất là 30oC cho 2 chủng xạ khuẩn sinh trưởng và có hoạt tính enzyme cao nhất.
4.2.2. Ảnh hưởng của giá trị pH
pH của môi trường có ý nghĩa quyết định đối với sinh trưởng của nhiều vi sinh vật. Chính vì vậy, việc xác định pH ban đầu thích hợp và việc duy trì pH trong thời gian sinh trưởng của xạ khuẩn là rất quan trọng. Từ những lý do trên ta tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu trong môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn với độ pH thay đổi từ 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10 nuôi trên môi trường Gause lỏng ở 30oC trong 48h, sau đó tiến hành lọc sinh khối và đem sấy khô đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 45 oC và xác định hoạt tính enzyme của chúng.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn ở bảng 4.5 và hình 4.5.
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của các xạ
khuẩn nghiên cứu
Chủng Sinh khối khô(mg)
pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH10
T1 3,05 5,16 12,38 16,43 14,04 11,71 8,21
Hình 4.5. Kết quả ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn
Kết quả thí nghiệm trình bày trên bảng 4.5 và hình 4.5 cho thấy các chủng xạ khuẩn có thể sinh trưởng trong môi trường có pH thích hợp nằm ở khoảng 6- 8 và phát triển tốt nhất ở pH=7. Việc nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường có ý nghĩa lớn trong nhân giống sản xuất chế phẩm.
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn (đường kính vòng phân giải D-d, mm) sau 48 giờ lên men ở 30°C
Chủng Hoạt tính cellulose (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH10
T1 4 8 12 24 13 8 3
T4 3 6 8 23 13 7 4
Chủng Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH10
T1 2 2 13 24 13 5 2
T4 2 5 14 25 13 4 3
Chủng Hoạt tính protease (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH10
T1 2 3 12 24 14 7 2
Hoạt tính cellulose (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Theo bảng 4.6 và hình 4.6 ta có thể thấy pH tốt nhất cho các chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp enzym là pH = 7. Đây là mức pH trung tính và rất tốt cho sự sinh tổng hợp enzym. Như vậy có thể nói pH tốt nhất cho cả việc nuôi cấy và sinh tổng hợp enzyme là pH bằng 7.
1.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ muối lên sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn ở bảng 4.7 và hình 4.7.
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên sinh trưởng của các xạ khuẩn
Chủng Sinh khối khô, mg/ml( nuôi 30
oC, 48 h)
0% 1% 3% 5% 7% 9% 11%
T1 12,12 14,56 5,01 2,56 2,49 0,19 0,05
T4 13,40 15,02 4,48 2,62 1,58 0,12 0,05
Hình 4.6: Kết quả của nồng độ muối lên sinh trưởng
Kết quả thí nghiệm trình bày trên bảng 4.11 và hình 4.7 cho thấy các chủng xạ khuẩn tuyển chọn có thể sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối thích hợp nằm ở khoảng 0-3% và phát triển tốt nhất ở nồng độ muối là 1%.
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên sinh tổng hợp enzyme của các chủng xạ khuẩn (đường kính vòng phân giải D-d, mm) sau 48 giờ lên
men ở 30°C
Chủng Hoạt tính cellulose (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
0% 1% 3% 5% 7% 9% 11%
T1 8 12 10 6 2 2 0
T4 6 14 12 6 2 1 0
Chủng Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
0% 1% 3% 5% 7% 9% 11%
T1 4 13 11 10 3 2 0
T4 5 15 11 7 2 1 0
Chủng Hoạt tính protease (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
0% 1% 3% 5% 7% 9% 11%
T1 7 17 13 4 1 0 0
T4 8 15 14 6 2 0 0
Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
1.4.4.Ảnh hưởng của nồng độ oxy
Kết quả ảnh hưởng của nồng độ oxy tới sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn được trình bày ở bảng 4.9 và hình.4.9
Bảng 4.9: Ảnh hưởng của nồng độ oxy lên sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn
Chủng Sinh khối khô(mg)
25ml 50ml 75ml 100ml 125ml 150ml
T1 2,11 2,21 3,45 4,56 5,57 5,02
Hình 4.7: Kết quả ảnh hưởng của nồng độ oxy lên sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn
Kết quả thí nghiệm trình bày trên bảng 4.9 và hình 4.9 cho thấy các chủng xạ khuẩn có thể sinh trưởng trong môi trường có thể tích dịch thể là 125m cho sinh khối khô lớn nhất là 5,57 g(chủng T1) và 6,23 g( chủng T4).
Bảng 4.10. Ảnh hưởng của nồng độ oxy lên hoạt tính enzyme của các chủng xạ (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Chủng 25mlHoạt tính cellulose (đường kính vòng phân giải D-d, mm)50ml 75ml 100ml 125ml 150ml
T1 4 6 7 10 12 9
T4 5 7 8 9 13 8
Chủng Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
25ml 50ml 75ml 100ml 125ml 150ml
T1 3 5 5 6 14 10
T4 6 7 8 8 12 8
Chủng Hoạt tính protease (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
25ml 50ml 75ml 100ml 125ml 150ml
T1 5 6 6 7 10 8
Hoạt tính cellulose (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Hoạt tính protease (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Theo bảng 4.10 và hình 4.10 ta có thể thấy hoạt tính enzyme mạnh nhất tốt nhất ở bình chứa 125ml thể tích môi trường. Khi thể tích môi trường thấp đồng nghĩa với việc nồng độ oxy thấp cho kết quả D-d nhỏ, khi thể tích môi trường tăng thì nồng độ oxy tăng dẫn đến kết quả cao hơn rõ rệt. Ví dụ với chủng T1 là 14mm hoạt tính enzym amylase ,với chủng T4 là 13mm hoạt tính enzyme cellulose và hoạt tính enzym protease.
Như vậy, có thể kết luận 2 chủng xạ khuẩn sinh trưởng và hoạt tính enzyme tốt nhất ở nồng độ oxy cao.
4.2.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Dinh dưỡng vi sinh vật là quá trình chuyển hóa các nguồn cacbon thành những chất dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật. Nhiều chất hữu cơ không tan trong nước hoặc do có trọng lượng phân tử lớn nên không thể xâm nhập được vào tế bào vi sinh vật (cellulose, tinh bột, pectin,...). Muốn hấp thụ được các chất này vi sinh vật phải tiết ra môi trường các enzyme để thủy phân chúng thành những phần nhỏ hơn. Mỗi loại vi sinh vật thường sinh trưởng và phát triển tốt trên một số nguồn cacbon nhất định. Ảnh hưởng của các nguồn
cacbon khác nhau lên sinh trưởng phát của chủng xạ khuẩn nghiên cứu được trình bày ở các bảng 4.16 và hình 4.10.
Bảng 4.11. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn
Xạ khuẩn
Sinh khối khô (mg)
CMC Sacarose Glucose Lactose Tinh bột
T1 18,2 20,24 23,92 7,51 21,40
T4 18,7 13,40 19,63 6,63 13,25
Hình 4.8: Kết quả ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn
Kết quả ở bảng 4.11 và hình 4.11 cho thấy các chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều có khả năng sinh trưởng trên các nguồn cacbon nghiên cứu. Chúng sinh trưởng tốt nhất trong môi trường có nguồn cacbon là glucose. Trong môi trường có nguồn cacbon là lactose chúng phát triển yếu hơn. Xạ khuẩn là vi sinh vật có cấu tạo tế bào giống vi khuẩn Gram dương, song chúng sinh trưởng và phân nhánh mạnh, tạo thành hệ khuẩn ty. Chúng có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện môi trường khá khắc nghiệt, nhờ có hệ enzyme cần thiết để phân hủy các hợp chất hữu cơ có phân tử lớn thành những phần nhỏ hơn để có thể hấp thu được.
Kết quả hoạt tính sinh enzyme cellulase, amylase và protease của các chủng xạ khuẩn trong các môi trường có nguồn cacbon khác nhau được trình bày ở bảng 4.12 và hình 4.12.
Bảng 4.12. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh tổng hợp enzym của các chủng xạ khuẩn (đường kính vòng phân giải D-d, mm) Xạ
khuẩn
Hoạt tính celluase(đường kính vòng phân giải D-d, mm)
CMC Sacarose Glucose Lactose Tinh bột
T1 23 15 17 11 20
T4 25 20 18 12 23
Xạ khuẩn
Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm) CMC Sacarose Glucose Lactose Tinh bột
T1 28 15 19 15 24
T4 26 20 18 14 23
Xạ khuẩn
Hoạt tính protease (đường kính vòng phân giải D-d, mm) CMC Sacarose Glucose Lactose Tinh bột
T1 25 17 20 15 23
T4 24 19 17 14 20
Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Hoạt tính protease (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Kết quả thu được ở bảng 4.12 và hình 4.12 cho thấy, các chủng xạ khuẩn đều có hoạt tính enzyme cellulase, amylase và protease trên môi trường có các nguồn cacbon nghiên cứu. Chúng sinh tổng hợp enzyme tốt nhất trên môi trường có nguồn cacbon là CMC. Glucose không ức chế sinh tổng hợp cellulase của các chủng tuyển chọn. Ta thấy các chủng xạ khuẩn cho kết quả vòng phân giải khác nhau trên những môi trường chứa nguồn cacbon khác nhau. Kết quả này cũng phù hợp với những nghiên cứu của Spirodonov và
Wilson [20], khi nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn cacbon lên sinh tổng hợp xenlulase của chủng xạ khuẩn Thertmomonospora fusca.Lactose là nguồn cacbon kém thích hợp hơn cho sinh trưởng và hoạt tính cellulase, amylase và protease của hầu hết các chủng xạ khuẩn.
4.2.4. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ
Nitơ là nguồn dinh dưỡng không thể thiếu của vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng. Nitơ có trong môi trường nuôi cấy xạ khuẩn có thể ở dạng vô cơ hoặc hữu cơ. Tìm hiểu ảnh hưởng các nguồn nitơ lên sinh trưởng và tổng hợp cellulase, amylase và protease cũng là yếu tố quan trọng giúp tối ưu hóa các điều kiện của quá trình lên men. Để lựa chọn được nguồn nitơ thích